镉胁迫对蓖麻有机酸含量及镉吸收的影响

王沛琦，胡尊红，胡学礼，刘旭云，杨 谨，李文昌

（云南省农业科学院经济作物研究所，云南昆明650205）

镉（Cd）是毒性最强的重金属之一[1]，其具有极高的迁移性和生物可利用性，Cd 在植物体内累积会对其造成极大的毒害，并使作物减产；同时Cd 进入食物链后还会直接危害人类健康[2-3]。许多研究表明，植物产生的有机酸在植物外部排斥Cd 和内部耐受Cd 的机制中起着重要的作用[4-5]。植物体内或根系环境中的有机酸含有1 个或多个羧基，其作为重金属元素的配基，与重金属配位结合，改变重金属的形态，降低重金属的毒性等[6-8]。PINTO 等[9]研究发现，Cd 胁迫下玉米主要产生柠檬酸，高粱主要产生苹果酸，这些有机酸与Cd 发生络合沉淀，变成低毒或无毒的Cd 络合物，减少了Cd 对根系的毒害性，进而提高了植物的耐受机制。秦丽等[10]研究表明，随着Cd 胁迫浓度的增加以及胁迫时间的延长，续断菊根部合成的有机酸总量均呈上升趋势，说明植物可以通过调节根系分泌物来改变根际状态以适应Cd 的胁迫，减轻Cd 对植物的伤害。孙瑞莲等[11]研究认为，叶片中的有机酸含量与其Cd 生物积累量有关，其中，酒石酸、柠檬酸和乙酸可以指示不同生育期龙葵叶片中镉的积累量。可见，Cd 胁迫会刺激植物产生有机酸，与进入植物体内的Cd 进行络合，进而提高植物的抗性。目前，有关蓖麻对重金属Cd 的吸收及Cd 胁迫下蓖麻体内有机酸含量对Cd积累调控的研究相对较少。

本研究以前期筛选出来的耐Cd 蓖麻品种滇蓖2 号为材料，采用盆栽试验，分析了蓖麻根及叶片中草酸、苹果酸、柠檬酸3 种有机酸的含量差异及其与植株中镉积累的关系，以期评价有机酸在蓖麻Cd 积累与解毒过程中的作用，为Cd 污染农田土壤的修复提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为宿生耐镉蓖麻品种滇蓖2 号，由云南省农业科学院经济作物研究所选育。

试验土壤取自云南省农业科学院老楼耕作层（0～20 cm）的土壤，土壤类型为红壤土，其基本理化性质如表1 所示。

表1 供试土壤理化性质

1.2 试验设计

2019 年在云南省农业科学院经济作物研究所温室进行盆栽试验。每个花盆装风干过筛土20 kg，以分析纯 CdCl2·2.5 H2O 为处理剂，设 6 个 Cd2+质量分数水平，分别为 0（CK）、20、50、100、200、300 mg/kg，共 6 个处理，每个处理 3 个重复，共 18 盆。CdCl2·2.5 H2O 与风干土充分混匀装盆后，静置平衡20 d[11]。选取成熟饱满的蓖麻种子经10%次氯酸钠消毒，用温水浸泡24 h 后，每盆播种6 粒，出苗后每盆定苗3 株，正常水分管理。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 生物量测定 Cd 胁迫60 d 后，对蓖麻植株的株高、根长、侧根数、地上部鲜质量、地下部鲜质量进行测定。待其自然阴干后对其干质量进行测定。

1.3.2 体内有机酸测定 Cd 胁迫60 d 后，分别称取去叶脉的新鲜干净叶片和根0.5 g，加入2 mL0.5 mol/L的HCl 研磨成匀浆，于60 ℃水浴中提取l h；匀浆离心后取上清液过滤，定容至50 mL，4 ℃保存。采用外标法测定植物体内与重金属螯合的3 种主要有机酸（草酸、苹果酸、柠檬酸）的含量[12]。HPLC 液相条件：Agilent 1 100 高效液相色谱仪，Kromasil C18 反相色谱柱（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm），流动相为10 mmol/L 磷酸二氢钠（用磷酸调节溶液pH为 2.8），进样量为 10 μL，流速为 0.8 mL/min，柱温25 ℃，走样时间为20 min，紫外波长214 nm。以草酸、苹果酸、柠檬酸为标准样品。

1.3.3 植株重金属Cd 含量测定 Cd 胁迫60 d 后，植物样品（根、茎、叶）在105 ℃下杀青30 min，然后70 ℃烘箱烘干至恒质量，用电子天平分别称量各部分干质量。采用植物粉碎机粉碎样品后过筛，备测。样品采用浓硝酸－高氯酸（V浓硫酸∶V高氯酸＝4∶1）的混合液进行微波消解后，定容并过滤，用原子火焰分光光度计对植株Cd 含量进行测定[1]。

式中，C1、C2、C3、C4分别代表蓖麻根部、茎、叶及土壤的 Cd 含量（mg/kg）；M1、M2分别代表根部生物量（g）及蓖麻茎叶生物量（g）。

1.4 数据处理

采用Excel 2007 对试验数据进行处理并作图；用SPSS Statistics 19.0 软件对数据进行方差分析和差异显著性检验（Duncan，P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 Cd 胁迫对蓖麻植株生长的影响

从表2 可以看出，蓖麻植株的生长随着Cd 胁迫质量分数的增加呈现出先升高后下降的趋势，其中，株高、茎粗、根长、侧根数、根干质量及地上部分干质量在低剂量（20 mg/kg）胁迫下与对照相比均增加，且差异达显著水平（P＜0.05）；在Cd 质量分数为50 mg/kg 时，株高、茎粗、根长、侧根数、根干质量及地上部分干质量较20 mg/kg 有所下降，但株高、侧根数、根干质量及地上部分干质量与对照相比有一定增加，茎粗、根长较对照相比有所下降，但差异不显著；随着Cd 胁迫质量分数升高各指标逐渐降低，在Cd 质量分数为300 mg/kg 时达到最小值，较CK 分别下降了 68.33%、53.85%、51.73%、91.62%、92.19%及93.00%，与对照相比差异均达显著水平（P＜0.05）。综上所述，蓖麻在Cd 胁迫下呈现出低促高抑的现象。

表2 Cd 胁迫对蓖麻植株生长的影响

2.2 蓖麻对Cd 的富集特征

由表3 可知，蓖麻根、茎及叶中Cd 含量随着Cd 质量分数的增加而逐渐增加；在Cd 质量分数为20 mg/kg 时，根、茎及叶中Cd 含量与对照相比差异不显著，当Cd 质量分数为50 mg/kg 及以上时，根、茎及叶中Cd 含量大幅增加，蓖麻各组织富集Cd 的能力并无下降或趋于饱和的状态，且与对照相比呈显著差异（P＜0.05）。在Cd 胁迫时，蓖麻各组织Cd含量总体呈现出根＞茎＞叶。

表3 蓖麻对Cd 的富集和转运系数

从富集系数看，不同Cd 质量分数下，蓖麻根对Cd 的富集系数为1.28～4.33，均大于1，当Cd 质量分数为300 mg/kg 时，蓖麻根对Cd 的富集能力最强，当Cd 质量分数为50 mg/kg 时，蓖麻根对Cd 的富集能力最弱；蓖麻茎、叶对Cd 的富集系数均小于1，其中，当 Cd 质量分数为 300 mg/kg 时，蓖麻茎对Cd 的富集能力最强，当Cd 质量分数为50 mg/kg时，蓖麻茎对Cd 的富集能力最弱，当Cd 质量分数为20 mg/kg 时，蓖麻叶对Cd 的富集能力最强，当Cd 质量分数为300 mg/kg 时，蓖麻叶对Cd 的富集能力最弱。从转运系数看，不同浓度下蓖麻对Cd 的转运系数均小于1，说明在较高剂量的Cd 胁迫下，蓖麻由根向茎叶转运镉的能力较弱，蓖麻将大部分Cd 积累在根部，限制Cd 向上转移。

2.3 有机酸含量测定

3 种有机酸混合标样的HPLC 图谱如图1 所示，3 种有机酸待测样品的图谱如图2 所示，3 种低分子量有机酸检出的顺序依次为草酸、苹果酸、柠檬酸。通过外标法建立的线性回归方程为：草酸，y＝4.095 1x－16.41（R2＝0.999 9），保留时间为3.610 min；苹果酸，y＝0.489 4x－0.956 4（R2＝0.999 5），保留时间为 5.707 min；柠檬酸，y＝0.159 9x＋1.533 6（R2＝0.999 4），保留时间为11.790 min。

2.4 Cd 胁迫对蓖麻3 种有机酸含量的影响

由图3 可知，随着Cd 质量分数的提高，蓖麻根部3 种有机酸含量变化明显，草酸的含量随着Cd质量分数的升高逐渐降低，当Cd 质量分数达到300 mg/kg 时，草酸含量下降到20.73 mg/g，仅为对照的56.55%。苹果酸、柠檬酸含量随着Cd 质量分数的升高呈现出先增加后降低的趋势，苹果酸在Cd 质量分数为50 mg/kg 时达到最大，为0.69 mg/g，柠檬酸在Cd 质量分数为20 mg/kg 时达到最大，为3.95 mg/g；当 Cd 质量分数达到 300 mg/kg 时，苹果酸、柠檬酸含量均下降到最低，分别为0.34、1.20 mg/g，分别为对照的84.47%和32.18%，柠檬酸的下降幅度大于苹果酸。Cd 处理下，根部有机酸含量大小为草酸＞柠檬酸＞苹果酸。

由图4 可知，随着Cd 质量分数的升高，蓖麻叶片中3 种有机酸的含量均呈现出先增加后降低的趋势，在Cd 质量分数为50 mg/kg 时3 种有机酸含量达最大，但上升幅度各不相同，草酸、苹果酸、柠檬酸分别上升到7.59、6.76、28.05 mg/g；当Cd 质量分数达到300 mg/kg 时，草酸、苹果酸、柠檬酸含量均下降到最低，分别为3.22、1.02、11.48 mg/g，分别为对照的97.57%、32.36%和59.53%，苹果酸的下降幅度最大，其次是柠檬酸，且二者与对照间呈显著差异，草酸下降幅度最小，与对照间差异不显著。Cd 处理下，叶片有机酸含量大小为柠檬酸＞草酸＞苹果酸。

2.5 蓖麻体内Cd 含量与3 种有机酸含量的相关性分析

植物体内有机酸主要是光合作用及呼吸作用的中间产物，受植物生长状况的影响，有机酸在植物体内重金属的积累中发挥了较大作用[5]。本研究中，3 种有机酸在Cd 质量分数为100 mg/kg 时均表现出下降的趋势，故以Cd 剂量为100 mg/kg 为分界点，对蓖麻体内Cd 含量与3 种有机酸含量的相关性进行分析。

从表4 可以看出，蓖麻3 种有机酸含量与不同器官的镉含量之间存在显著的相关性；当Cd 质量分数＜100 mg/kg 时，草酸与柠檬酸含量与根、茎、叶中Cd 含量呈显著负相关，苹果酸含量与根、茎、叶中Cd 含量呈显著正相关。

表4 Cd 质量分数 ＜100 mg/kg 时蓖麻体内Cd 含量与根部有机酸含量的相关性

从表5 可以看出，当Cd 质量分数≥100 mg/kg时，草酸、柠檬酸及苹果酸含量与根、茎、叶中Cd 含量呈极显著负相关。

表5 Cd 质量分数≥100 mg/kg 时蓖麻体内Cd 含量与根部有机酸含量的相关性

蓖麻根、茎、叶Cd 含量与叶片有机酸含量的相关性如表6、7 所示。当Cd 质量分数＜100 mg/kg 时，草酸、苹果酸与柠檬酸的含量与根、茎、叶中Cd 含量为极显著正相关，其中，草酸与苹果酸与根中Cd含量的相关系数最大，为0.999，柠檬酸与茎及叶中Cd 含量的相关系数最大，分别为0.990、0.992（表6）；当 Cd 质量分数≥ 100 mg/kg 时，叶片中草酸、柠檬酸及苹果酸含量与根、茎、叶中Cd 含量均呈显著负相关（表 7）。

表6 Cd 质量分数＜100 mg/kg 时蓖麻体内Cd 含量与叶片有机酸含量的相关性

表7 Cd 质量分数≥100 mg/kg 时蓖麻体内Cd 含量与叶片有机酸含量的相关性

3 结论与讨论

重金属对植物具有强的毒害作用，其中，植物农艺性状、生物量等可作为评价植物对重金属逆境胁迫耐性最直观的指标[13]。景俏丽等[14]研究表明，低浓度Cd 可以促进植物生长，高浓度Cd 会抑制植物生长。本研究发现，蓖麻幼苗在低质量分数（20、50 mg/kg）Cd 胁迫下，植株生长正常，且株高、侧根数、根干质量及地上部分干质量较对照略有增加；随着Cd 质量分数的升高，各指标较对照有所下降，当Cd 质量分数达到300 mg/kg 时，植株各农艺性状较对照显著降低，叶片发黄，根部有黑点，生长受到抑制，但是没有致死，说明蓖麻耐镉能力较强。

富集和转运系数是衡量植物对重金属积累能力的一项重要指标[15]。本研究表明，蓖麻根对不同质量分数Cd 的富集系数均大于1，茎叶对Cd 的富集系数均小于1，转移系数均小于1，说明蓖麻对Cd 由根部向地上部分转运能力较弱，将大部分Cd积累在根部，以此来减少Cd 对蓖麻植株的毒害，这可能是蓖麻对Cd 有很强的耐性的原因之一[16]。

在重金属污染下，进入植物体内的重金属可以与储存在液泡中的有机酸络合，形成低毒的络合物，从而增强植物的耐性，对植物抵抗重金属毒害起重要作用[17-20]。许多研究表明，植物体内及植物根际与重金属螯合的主要有机酸是草酸、苹果酸和柠檬酸[21-22]。本研究对Cd 胁迫下蓖麻叶片及根系中的草酸、苹果酸和柠檬酸的含量进行测定，结果发现，不同胁迫下有机酸含量存在差异，蓖麻叶片中有机酸含量大小为柠檬酸＞草酸＞苹果酸，随着Cd 质量分数的提高，3 种有机酸的含量呈现出先增加后降低的趋势，在Cd 质量分数为50 mg/kg 时3 种有机酸含量均达最大值，这与孙瑞莲等[11]对Cd 超积累植物龙葵的研究结果相一致；蓖麻根部有机酸含量大小为草酸＞柠檬酸＞苹果酸，其中，草酸的含量随着Cd 质量分数的升高逐渐降低，苹果酸、柠檬酸含量随着Cd 质量分数的升高呈现出先增加后降低的趋势。虽然Cd 胁迫对蓖麻根内草酸含量有抑制作用，但草酸含量明显高于柠檬酸和苹果酸，蓖麻叶片中柠檬酸含量最高，说明草酸和柠檬酸可能在蓖麻对Cd 富集和抗性中起主要作用。当Cd 质量分数小于100 mg/kg 时，根系含有的苹果酸，叶片含有的草酸、苹果酸和柠檬酸与蓖麻体内Cd 含量呈正相关；大于100 mg/kg 时根及叶片中3 种有机酸与蓖麻体内Cd 含量均呈负相关，说明低剂量Cd 胁迫下，蓖麻根中的苹果酸及叶片中的草酸、苹果酸与柠檬酸的积累增强有助于根、茎叶中镉的富集，而在高质量分数Cd 胁迫下蓖麻体内Cd 抑制了有机酸的合成。本研究仅对Cd 胁迫下蓖麻体内Cd 含量及根、叶的有机酸含量进行了研究，对蓖麻体内积累的草酸、苹果酸及柠檬酸能否通过根系分泌作用活化环境中的镉，并促进Cd 从根部转运到茎部，还有待进一步研究。