水烛香蒲不同部位黄酮类化合物的动态分析

巢蕾 高明亮 曹雨诞 陈佩东 严辉

摘 要：  为了分析水烛香蒲花粉和茎叶中黄酮类成分，以及不同生长期、不同部位中香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷和异鼠李素含量。该文采用UPLC-Q-TOF-MS进行定性分析，结合HPLC法对水烛香蒲不同部位中黄酮类化合物含量进行分析评价，色谱条件为PRAZIS C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.05%磷酸为流动相，梯度洗脱，体积流量1.0 mL·min-1，检测波长254 nm，柱温30 ℃。结果表明：（1）花粉及茎叶中共解析出42个化合物，其中8个化合物在不同部位中有差异。（2）同一生长环境的水烛香蒲不同生长时期、不同部位中3种黄酮类化合物的含量差异较大。（3）异鼠李素-3-O-新橙皮苷及异鼠李素在香蒲的发育生长过程中含量呈先增加后下降的趋势，茎叶内的这两种成分含量下降明显;在花粉中，香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量急剧上升，一周内达到峰值;茎叶中香蒲新苷含量较低，在大多数样品中未检出。该研究所建立的测定方法简便、重现性好，并对水烛香蒲中黄酮类成分的含量变化规律进行了研究，对花粉及茎叶中化合物差异进行了分析，为蒲黄的合理采收及香蒲植物的资源化利用提供了科学依据。

关键词： 水烛香蒲， 香蒲新苷， 异鼠李素-3-O-新橙皮苷， 异鼠李素， 动态分析

中图分类号：  Q946

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2021）05-0831-12

Abstract：  Inorder to analyze flavonoids in pollen， stem and leaf of Typha angustifolia and the contents of typhaneoside， isorhamnetin-3-O-neohesperidoside and isorhamnetin in different parts of growth periods. UPLC-Q-TOF-MS was used for qualitative analysis， combined with HPLC to analyze and evaluate the contents of flavonoids in different parts of T. angustifolia. A RPAZIS C18 column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） was adopted. The mobile phase was composed of acetonitrile-0.05% phosphoric acid with a gradient elution. The flow rate was 1.0 mL·min-1， the detection wavelength was 254 nm， and the column temperature was 30 ℃. The results were as follows： （1） A total of 42 compounds were identified in pollen， stem and leaf， and eight compounds with great differences in different parts. （2） The contents of three flavonoids in different parts of T. angustifolia during different growth periods in the same growth environment were significantly different. （3） The contents of isorhamnetin-3-O-neohesperidoside and isorhamnetin in the plant were increased first and then decreased， while decreased significantly in the stem and leaf; In pollen， the contents of typhaneoside and isorhamnetin-3-O-neohesperidoside increased quickly and reached a peak within a week; The contents of isorhamnetin in stem and leaf were low and were not detected in most samples. This established method in this study was simple and reproducible. The changes regularity of the flavonoids content in T. angustifolia had been studied and the differences of compounds in pollen， stem and leaf were also analyzed. This research provides a scientific basis for reasonable resource utilization of T. angustifolia.

Key words：  Typha angustifolia， typhaneoside， isorhamnetin-3-O-neohesperidoside， isorhamnetin， dynamic analysis

香蒲屬（Typha）植物为香蒲科（Typhaceae）多年生水生或沼生植物，广泛分布于热带至温带地区（王茹等，2013），全世界有24种，其中我国分布有12种。《中国药典》2015版规定，蒲黄药材为水烛香蒲（Typha angustifolia）、东方香蒲（T. orientalis）或同属植物的干燥花粉（国家药典委员会，2015），具有止血、化瘀、通淋之功效（代玄烨，2017）。蒲黄中含有黄酮类、酚酸类、脑苷、腺苷、甾体类及多糖类等多种成分（陈毓等，2015;白雪薇等，2018;Zeng et al.， 2018），其中黄酮类成分为其主要有效成分，具有改善胰岛素抵抗、抑制炎症、改善血液流变学状态以及止血及抗氧化等作用（Chen et al.， 2017;Lei et al.， 2018）。

香蒲属植物的茎叶与花粉的化学成分组成类似，均有促进伤口愈合的作用（Ondua et al.， 2019）。除药用外，香蒲属植物在食品、饮料、保健品、材料、肥料、工艺品中也有广泛应用，而且在水体环境保护方面，香蒲属植物具有独特的应用价值（陈佩东等，2015）。前期开展的江苏省中药资源普查过程中发现，江苏地区的香蒲属植物野生资源量较大，主要以花粉利用为主，但是茎、叶等其他部位的资源化利用并不充分。蒲黄一般在每年6月份采收（严华等，2019），由于分布廣泛，地理生态环境、采收方式等因素的影响，各地采收的花粉中化学成分的组成存在较大差异，同时，花粉中化学成分的动态变化规律也需要深入研究。因此，本课题组首先在江苏省南京市进行了定点连续采样，然后基于UPLC-Q-TOF-MS技术对水烛香蒲花粉、茎叶中的化学成分进行定性研究，同时基于HPLC技术对水烛香蒲不同生长时期花粉和茎叶中3种黄酮类化合物（香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷和异鼠李素）的含量进行定量分析，以期探究香蒲属植物的资源性化学成分在不同部位的分布情况以及积累的动态，为香蒲属植物的资源化学成分的进一步动态评价及开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 AB SCIEX Triple TOFTM 5600质谱仪，电喷雾离子源（ESI）（美国AB SCIEX公司），TF 1.6 Analyst工作站以及Peak View分析软件，配备LC-20A型液相色谱仪（日本岛津公司）。Agilent 1290高效液相色谱仪;Micro CL21R高速冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific）;JY10002电子天平（上海上平仪器有限公司）;扫描电镜（日本Hitachi S-4800）;420三用恒温水箱（江苏金坛国胜实验仪器厂）;KQ-500B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;DHG-9023A型电热鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）;TGL-16C型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.1.2 试剂 对照品：香蒲新苷（批号：Y14S8H43976），异鼠李素-3-O-新橙皮苷（批号：H30M3X1），异鼠李素（批号：P23A9F68614），琥珀酸（批号：B20937），对羟基苯甲酸（批号：MKBK3576V），山奈酚-3-O-葡萄糖苷（批号：Y19M8H36474），异鼠李素-3-O-芸香糖苷（批号：S08A8D33447），槲皮素（批号：C09S8Y43412），柚皮素（批号：X21M7C11378），山柰酚（批号：C26J8Y38642）均购自源叶生物科技有限公司。甲醇（色谱纯，批号：180975，江苏汉邦科技有限公司）;乙腈（色谱纯，批号：SHBK5734，默克股份有限公司）;磷酸（色谱纯，批号：C1801089，阿拉丁）。

1.1.3 药材 蒲黄样品采集于江苏省南京市栖霞区仙林湖（118°58′59.33″ E、32°07′28.38″ N），原植物经南京中医药大学中药资源学教研室严辉副教授鉴定为香蒲科植物水烛香蒲（Typha angustifolia）。

1.2 方法

1.2.1 蒲黄样品采集及前处理 自2019年3月31日起，每隔7天采集一次样品，至有雄花序后，每2天采集1次花粉。采集的蒲黄茎叶，记录生长情况。样品性状见图1，样品株高及基部直径数据见表1。60 ℃恒温干燥后打粉，过三号筛。蒲黄花粉置纱筛中，保持水平状态过筛，除去杂质。

花粉在用扫描电镜拍照前，经过如下处理：将花粉粒固定在甲醛溶液（5 mL 38%甲醛、5 mL冰醋酸、90 mL 50% 乙醇和5 mL甘油）中，在24 ℃下，分别用浓度为70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液水合20 min。分别用乙醇和乙酸异戊酯混合溶液（比例为75%∶25%、50%∶50%、25%∶75%和100%乙酸异戊酯）处理20 min，4 h后冷冻干燥（Gao et al.， 2019）。

1.2.2 UPLC-Q-TOF-MS分析

1.2.2.1 液相色谱条件 Waters ACQUITYTM UPLC HSS T3色谱柱（100 mm × 2.1 mm， 1.8 μm），流速 0.3 mL·min-1，柱温 30 ℃，进样量 4 μL，流动相为0.1%甲酸水溶液（A）（v/v），乙腈（B），梯度洗脱为0～10 min，15% B;10～15 min，15%～30% B;15～25 min，30%～50% B;25～28 min，50%～15% B;28～30 min，15%（Ding et al.， 2018）。

1.2.2.2 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），分别在正负离子模式下采集。主要参数设置如下：喷雾电压（IS）：4 500 V，离子源温度（TEM）：550 ℃，气帘气（Curtain Gas）：40 psi，雾化器（GS1）：55 psi，辅助加热器（GS2）：55 pis，周期时间：1 300 ms，去簇电压（DP）：-100 V，碰撞能量（CE）：-40 V，脉冲频率：15.420 kHz，质量数扫描范围m/z 50～1 500。

1.2.2.3 供试品溶液制备 精密称定2019年6月15日所采集蒲黄花粉和茎叶干燥粉末各1.0 g，于100 mL具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL超声提取45 min。待其冷却后补足甲醇超声过程中减少的重量，吸取上清液，经0.45 μm滤膜进行过滤，取续滤液作为供试品溶液。

1.2.3 水烛香蒲不同部位的黄酮类成分含量测定

1.2.3.1 供试液的制备 取样品约0.5 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，冷浸12 h后加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，取续滤液，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

1.2.3.2 对照液的制备 精密称取香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、异鼠李素适量，分别加甲醇10 mL制成香蒲新苷浓度为48.51 μg·mL-1，异鼠李素-3-O-新橙皮苷浓度为30.97 μg·mL-1，异鼠李素浓度为3.23 μg·mL-1，4 ℃保存备用。

1.2.3.3 色谱分析条件 色谱柱为PRAZIS C18 （250 mm × 4.6 mm，5 μm，LOT：PA181711）;流动相为乙腈（B）-0.05%磷酸（A）;柱溫30 ℃;流速1.0 mL·min-1;进样量10 μL;梯度洗脱条件为0～5 min，95.0%～86.0% A;5～10 min，86.0%～68.0% A;10～15 min，68.5% A;15～40 min，68.5%～55.0% A;40～43 min，55.0%～95.0% A;43～46 min，95.0% A（Gao et al.， 2019）。色谱峰与临近峰分离度大于1.5，理论塔板数不低于5 000，具体见图2。

1.2.3.4 线性关系 精密吸取1.2.3.2项下对照品溶液逐级稀释，香蒲新苷（48.51、24.25、12.13、6.06、3.03、1.52 μg·mL-1）、异鼠李素-3-O-新橙皮苷（30.97、15.48、7.74、3.87、1.94、0.97、0.48 μg·mL-1）、异鼠李素（3.23、1.62、0.81、0.40、0.20、0.10、0.05 μg·mL-1），分别精密吸取10 μL，按照上述色谱条件分析。以对照品浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归;分别以信噪比S/N=3，10为基准计算检测限（LOD），定量限（LOQ）。结果得到香蒲新苷的回归方程：Y=10.998X-1.216，r=0.999 9;异鼠李素-3-O-新橙皮苷的回归方程：Y=13.599X+0.374 8，r=0.999 9;异鼠李素的回归方程：Y=53.763X-0.464 2，r=

0.999 8。各对照品在该浓度范围内与峰面积呈现良好的线性关系。香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷及异鼠李素的检测限分别为0.126 3、0.379 0、0.242 0 μg·mL-1，定量限分别为0.322 6、0.025 3、0.033 7 μg·mL-1。

1.2.3.5 精密度试验 精密吸取1.2.3.2项下同一份对照品溶液10 μL，在上述色谱条件下重复进样6次，计算各峰面积的相对标准偏差（RSD）考察仪器的精密度。测得香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、异鼠李素峰面积的RSD分别为1.31%、1.53%、1.17%，表明仪器的精密度良好。

1.2.3.6 重复性试验 精密称取同一批蒲黄花粉样品，按1.2.3.2项下制备方法制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进样，测得香蒲新苷平均含量3.372 0 mg·g-1，RSD为1.36%;异鼠李素-3-O-新橙皮苷平均含量2.402 1 mg·g-1，RSD为1.28%;异鼠李素平均含量0.006 2 mg·g-1，RSD为1.33%，表明该方法重复性良好。

1.2.3.7 稳定性试验 取1.2.3.2项下的同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12 h按上述色谱条件进样，每次10 μL。测得香蒲新苷峰面积的RSD为0.55%，异鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面积的RSD为0.56%，异鼠李素峰面积的RSD为1.94%，表明对照品溶液在12 h内稳定性良好。

1.2.3.8 加样回收试验 精密称取同一批蒲黄花粉6份，每份约0.25 g，分别精密加入1.2.3.2项下已知含量的对照品溶液，按1.2.3.1项下的制备方法制备后，在上述色谱条件下进样，具体数据见表2。测得香蒲新苷平均回收率为96.77%，RSD为2.67%;异鼠李素-3-O-新橙皮苷平均回收率为95.35%，RSD为1.10%;异鼠李素平均回收率为99.89%，RSD为2.89%，表明该方法的回收率较好。

2 结果与分析

2.1 蒲黄样品性状及生长情况

采集的样品及花粉性状见图1，样品株高及基部直径数据见表1。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS结果分析

水烛香蒲茎叶及花粉样品所得UPLC-Q-TOF-MS总离子流图见图2。由图2可知，大多数化合物能在花粉和茎叶中分别观察到，但不同部位的总离子流图谱还是存在明显差异，说明这些部位的化合物种类和含量有所不同。

高分辨质谱所得数据，经Peak View分析软件分析，根据准分子离子峰、碎片离子峰分析，结合已知化合物以及文献对照， 初步解析了水烛香蒲花粉及茎叶中所含的42个化合物。结果见表3。

水烛香蒲UPLC-Q-TOF-MS的定性分析共鉴定42个化合物，包括27个黄酮类成分，11个有机酸类成分，2个腺苷类成分，1个氨基酸以及1个聚酮类化合物。以往研究表明，尿苷在质谱中，容易脱去一分子核糖，从而生成m/z 110的碎片峰，我们的实验结果与文献一致（毛丰等，2014）。芦苇醇C的母核为聚酮类化合物（Enomoto et al.， 2006），质谱中出现了脱羧基、脱水以及侧链断裂的裂解碎片峰m/z 97（图3）。

香豆酸母离子m/z 163的二级谱图中最主要的碎片离子峰为m/z 119，由母离子丢失一个CO2形成（ [M-44]-）的碎片离子峰（李磊等，2012）。其他的有机酸如柠檬酸、琥铂酸等在电喷雾质谱中也容易脱去羧基，在此基础上进一步生成脱水的碎片离子峰（曾凯等，2019）。在本实验中，可以观察到无论芳香有机酸还是脂肪酸，都出现了脱羧基或脱水的碎片离子峰，具体见图4。

水烛香蒲中富含黄酮类化合物，苷元主要是异鼠李素、山柰酚、槲皮素等。在负离子模式下，黄酮苷类能得到较好的准分子离子峰，但在正离子模式下，能观察到较多的碎片离子峰，其中主要是苷键裂解碎片离子。如香蒲新苷，在正离子模式下可观察到三个糖苷键裂解的碎片峰（图5：A）。儿茶素和表儿茶素，经过A环或B环的裂解，容易得到m/z 245和m/z 205的碎片离子（图5：B）。而原儿茶酸m/z 153的二级谱图中最主要的碎片离子峰为m/z 109，由母离子丢失一个CO2 （ [M-44]-）所形成（刘国强等，2009;马悦等，2017）。

异鼠李素-3-O-新橙皮苷及异鼠李素-3-O-芸香糖苷均为异鼠李素-3-O-糖苷，是同分异构体，二者均裂解出m/z 479和m/z 317的碎片离子峰。在实验中，观察到异鼠李素-3-O-芸香糖苷的苷元更容易裂解成小碎片峰，与文献报道一致（Su et al.， 2010），具体见图6。

研究表明，槲皮素-7-O-糖苷，容易出现丢失葡萄糖基（M-162 Da）而生成Y-0（m/z 301）的碎片离子峰，但不易出现 [Y0-H]-离子（m/z 300）（Gegn， 2007）。本实验中，在碰撞能量（CE）为-40 V的条件下，槲皮素-3-O-（2G-α-L-鼠李糖基）-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷等化合物均观察到m/z 300的碎片离子峰，表明糖基没有连接在槲皮素苷元的7位羟基上，而3位和7位同时有糖苷键的芦丁却能观察到m/z 301.000 4的碎片离子峰。

2.3 蒲黄样品含量测定

各样品按1.2.3.1项下供试品制备方法制备，按上述方法测定，进样量为10 μL，注入液相色谱仪，测定。HPLC图谱见图7，检测结果见图8。结果表明，茎叶和花粉中均可检出异鼠李素和异鼠李素-3-O-新橙皮苷，但是含量以及时间有一定差异。6月后花粉中方可检测到这两种成分，并呈现出上升趋势。花粉中异鼠李素含量低于茎叶，而异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量高于茎叶。

3 讨论与结论

蒲黄为中医临床常用药物，来源于香蒲属植物花粉， 《本草分经》中即有蒲黄 “生用性滑，行血消瘀，炒黑性涩止血”的记载，在中医临床上是非常重要的药物（Wang et al.， 2020）。香蒲属植物作为多年生水生植物，其茎叶中成分除了具有抗癌等活性（Sorourian et al.， 2020），还可吸收池塘、湖泊中由于工业、农业排放的重金属及氮磷有机污染物，起到净化水体的作用（Hadad et al.， 2018;Di et al.， 2019）。香蒲植物茎叶生长期长且生物量较大，有较高的开发价值，但目前对香蒲植物茎叶的化学成分研究报道较少，资源综合利用极不充分，甚至出现由于采收花粉成本较高而放弃药用资源蒲黄的现象。通过UPLC-Q-TOF-MS技术对南京地区水烛香蒲的花粉和茎叶进行定性鉴别，并对不同生长期、不同部位的样品中香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷及异鼠李素进行定量分析，研究了香蒲植物生长过程中体内化学成分差异及累积过程规律，为充分开发和利用香蒲药用资源提供理论依据。

研究结果显示：水烛香蒲花粉和茎叶中共分析鉴定出42个化学成分，其中有8个化合物在不同部位中有差异。异鼠李素-3-O-新橙皮苷及异鼠李素在香蒲的发育生长过程中含量变化规律类似，都呈現先增加后下降的趋势，特别是临近雄花序的长出，茎叶内的这两种成分含量下降明显。在花粉中，香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量急剧上升，一周内达到峰值，而异鼠李素在花粉中含量更低。值得注意的是6月15日后，由于风雨天气频发，容易造成花粉大量损失，所以花粉采收的时间应在雄花序长出一周内完成。异鼠李素是一种常见的化学成分，但异鼠李素-3-O-新橙皮苷并不常见，而香蒲新苷更是只存在于少量的植物中（Tai et al.， 2010）。研究结果显示，香蒲新苷在茎叶中含量较低，大多数样品中均未检出，而花粉中拥有较高含量的香蒲新苷，这可能与香蒲属植物体内的酶定向催化有关。本研究对水烛香蒲中黄酮类成分的含量变化规律以及花粉、茎叶中的化合物进行了定性、定量分析，为香蒲属植物资源的综合利用和蒲黄合理采收提供了科学依据。

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（责任编辑 周翠鸣）