mTOR磷酸化水平对成骨细胞增殖和分化活性的影响

周哲雯,朱伊敏,王烨菠,王 萍,林函冰,李希宁

(湖州师范学院 医学院，浙江 湖州 313000)

骨质疏松症是一种典型的与老年相关的疾病，其核心发病机制是成骨细胞和破骨细胞的数量与活性失衡导致骨重建受损[1].成骨细胞是成骨的功能细胞，其数量增多和功能增强都可以促进骨形成.研究发现，成骨细胞功能障碍是骨质疏松的主要原因[2-3].目前预防和治疗骨质疏松症的药物主要集中于促进成骨细胞的增殖和分化.

哺乳动物雷帕霉素靶分子(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一个高度保守的激酶，属于PI3K家族的一员，与细胞的生长、增殖、分化等密切相关[4].雷帕霉素对mTOR的抑制作用在体外可损伤小鼠骨髓基质细胞(BMSCs)的增殖和成骨分化，并可导致小梁状骨的丢失[5].雷帕霉素抑制mTOR明显阻止了Wnt7b诱导的小鼠ST2细胞分化，相反激活mTOR可以促进BMSCs向成骨细胞方向分化[6]，但mTOR作用于成骨细胞的机制仍有待阐明.本研究分别利用mTOR抑制剂和激活剂改变mTOR磷酸化水平，探讨mTOR磷酸化对成骨细胞的影响，为骨质疏松的防治策略提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

α-MEM培养基、胎牛血清、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、胰蛋白酶(美国Thermo Fisher Scientific公司)；CCK-8试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、青链霉素双抗混合液(北京索莱宝科技有限公司)；mTOR、p-mTOR、ALP、Runx2、osterix抗体与引物(美国Abcam公司).

1.2 方法

(1) 细胞培养：MC3T3-E1细胞株购于中国科学院细胞库.将MC3T3-E1细胞培养于α-MEM完全培养液中，置于37 ℃、体积分数为5%CO2的培养箱中培养；每2～3 d更换一次培养液，当细胞密度铺满培养皿80%以上时，用胰蛋白酶消化传代培养至对数期.

(2) 采用细胞增殖(CCK-8)实验检测细胞增殖活性：将MC3T3-E1细胞接种于96孔板，培养时间为2 d；雷帕霉素浓度分别为0、20、40、60、80、100、120、140、160、180和200 nM，MHY1485浓度分别为0、0.5、1、1.5、2、4、6、8、10和12 μM，每组设8个复孔；培养结束后，每孔加入100 μL CCK-8溶液，轻微振动混匀，置于37 ℃培养箱内孵育2 h，用酶标仪测定波长为450 nm时的吸光值(A)，检测细胞增殖活性.

(3) 采用细胞周期检测试剂盒评估细胞周期：将MC3T3-E1细胞接种于6孔板，并将其分为对照组、50 nM雷帕霉素组、150 nM雷帕霉素组、2 μM MHY1485组；培养2 d后，将MC3T3-E1细胞经胰酶消化，收集并用PBS洗涤，随后加入70%冷乙醇于4 ℃恒温下固定过夜；用PBS将固定液冲洗掉，加入0.4 mL PI染料和0.1 mL RNase A于37 ℃培养箱内孵育30 min；利用流式细胞仪测定DNA含量，分析细胞周期分布.

(4) 采用蛋白免疫印迹法检测MC3T3-E1细胞中相关蛋白的表达：将MC3T3-E1细胞接种于6孔板，实验分组同上；采用RIPA裂解液提取总蛋白，每个泳道加入15 μg蛋白后进行SDS-PAGE电泳；电泳后转到PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入稀释后的抗小鼠一抗于4 ℃孵育过夜，将辣根过氧化物酶标记的二抗置于37 ℃培养箱内孵育1 h，增强化学发光法(ECL)显影，应用Gel Image System-1600凝胶成像系统采集图像.

(5) 采用Real-time PCR检测MC3T3-E1细胞中基因的表达：将MC3T3-E1细胞接种于6孔板，实验分组同上；培养2 d后，采用胰蛋白酶消化收集细胞，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，并用Nano-Drop分光光度计测定RNA含量；按照High-Capacity cDNAReverseTranscription Kit和Power SYBR R Green PCRMaster Mix说明书合成cDNA和PCR扩增(引物序列见表1)；使用StepOnePlus System software导出循环值(Ct值)，基因相对表达量采用2-(△Ct)计算.

表1 ALP、osterix和Runx2引物序列

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析.CCK-8增殖实验OD值、细胞周期分布的组间比较采用单因素方差分析；mRNA表达量、蛋白表达量采用双因素方差分析.检验水准α值取双侧0.05，P<0.05表示差异有统计学意义.

2 结 果

2.1 成骨细胞的增殖活性

用不同浓度的雷帕霉素处理MC3T3-E1细胞2 d后，发现20～140 nM雷帕霉素能够明显促进成骨细胞的增殖，过低或过高浓度的雷帕霉素对成骨细胞的活力无显著影响(图1A).根据实验检测结果，选择50 nM雷帕霉素作为有效刺激组，150 nM雷帕霉素作为增殖无效组，检测经不同浓度MHY1485处理后的成骨细胞增殖活性.结果显示，浓度高于0.5 μM MHY1485作用于成骨细胞2 d后可明显抑制成骨细胞的增殖，MHY1485对成骨细胞的作用呈浓度依赖性(图1B),最终选定2 μM MHY1485作为后续实验浓度.

图1 不同浓度的雷帕霉素和MHY1485对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响Fig.1 Effects of rapamycin and MHY1485 at different concentrations on proliferative activity of MC3T3-E1 cells

2.2 mTOR磷酸化水平的变化

用50 nM和150 nM雷帕霉素作用于MC3T3-E1细胞后，发现细胞内总mTOR无变化，但p-mTOR水平明显下降，且浓度越高对成骨细胞mTOR的磷酸化抑制作用越强，而2 μM MHY1485能明显促进mTOR的磷酸化水平(图2).

图2 雷帕霉素和MHY1485对MC3T3-E1细胞mTOR磷酸化水平的影响Fig.2 Effects of rapamycin and MHY1485 on mTOR phosphorylation in MC3T3-E1 cells

2.3 细胞周期的变化

结果显示，相比对照组MC3T3-E1细胞周期中G1期(76.38%)、S期(6.74%)和G2期(16.88%)，经50 nM雷帕霉素诱导后，MC3T3-E1细胞周期中G1期(64.66%)的比例明显下降，S期(15.96%)的比例明显上升，G2期(19.38%)的比例有所上升但变化不明显，说明50 nM雷帕霉素能够促使细胞从DNA合成前期进入DNA合成期，从而促进成骨细胞的增殖.经150 nM雷帕霉素和2 μM MHY1485作用后，MC3T3-E1细胞周期中G1期(82.35%、81.61%)的比例有所上升，但变化不显著，S期(12.03%、15.86%)细胞数明显增加，G2期(5.61%、2.54%)的比例显著下降(图3).结果提示，高浓度的雷帕霉素能过度抑制mTOR磷酸化和MHY1485激活mTOR磷酸化，阻止成骨细胞分裂使细胞周期停留在DNA合成期，起到相似的抑制细胞增殖活性的作用.

图3 雷帕霉素和MHY1485对MC3T3-E1细胞周期的影响Fig.3 Effects of rapamycin and MHY1485 on MC3T3-E1 cell cycle

2.4 成骨细胞分化活性的变化

检测mTOR在成骨细胞分化中的作用，采用western blot和real-time定量PCR检测与成骨细胞分化相关的转录因子ALP、osterix和Runx2的表达.结果显示，不同浓度的雷帕霉素对成骨细胞的作用不同，50 nM雷帕霉素明显诱导ALP和Runx2的表达，但osterix的变化不明显，在150 nM雷帕霉素作用下，ALP和osterix的表达显著升高，但Runx2的变化不明显，说明其不同程度地抑制了mTOR的磷酸化水平，可能通过不同方式影响成骨细胞的分化功能.2 μM MHY1485显著抑制了osterix的基因和蛋白水平，ALP的基因水平明显降低，蛋白表达变化不显著，对Runx2的影响不大(图4和图5).上述结果表明，降低mTOR的磷酸化水平，可以适当增强成骨细胞的早期分化功能，激活mTOR则可抑制成骨细胞的分化.

图4 蛋白水平分析雷帕霉素和MHY1485对MC3T3-E1细胞分化能力的影响Fig.4 Protein level analysis of the effects of rapamycin and MHY1485 on the differentiation ability of MC3T3-E1 cells

图5 基因水平分析雷帕霉素和MHY1485对MC3T3-E1细胞分化能力的影响Fig.5 Gene level analysis of the effects of rapamycin and MHY1485 on the differentiation ability of MC3T3-E1 cells

3 讨 论

mTOR是细胞对抗氧化应激和细胞存活的重要调节因子之一，可以被MHY1495激活，以维持线粒体功能[7].成骨细胞是骨形成的重要功能细胞，可以产生细胞外基质蛋白和基质矿化调节因子，参与早期骨形成和晚期骨重建.体外研究表明，成骨样细胞自噬的药理学诱导可降低其氧化应激，抑制细胞凋亡[8].

本研究结果显示，适宜浓度的雷帕霉素能够通过抑制mTOR磷酸化促进成骨细胞的增殖，而高浓度的雷帕霉素对成骨细胞的增殖作用呈下降趋势.MHY1485虽能促进mTOR磷酸化，但抑制了骨细胞的增殖.进一步分析细胞周期发现，适宜浓度的雷帕霉素能够促进细胞从DNA合成前期进入DNA合成期，促进成骨细胞的增殖；高浓度的雷帕霉素能够过度抑制mTOR磷酸化和MHY1485激活mTOR磷酸化，阻止成骨细胞分裂使细胞周期停留在DNA合成期，起到相似的抑制细胞增殖活性的作用.

成骨细胞分化标志物ALP、osterix和Runx2均可作为骨转化的标记蛋白，与骨吸收、骨形成和骨矿化密切相关[9-10].ALP是骨形成的血清标志物，与成骨细胞和破骨细胞活性的变化有关.Osterix是与成骨细胞分化和骨形成有关的转录因子，只在发育的骨组织中特异性表达.Runx2是一种转录因子，能诱导不成熟骨细胞向成熟的成骨细胞分化过程中起重要作用的转录因子Sp7，Sp7和经典Wnt信号转导将骨祖细胞直接分化为成骨细胞，从而抑制软骨细胞分化[11].本研究结果显示，ALP、osterix和Runx2的变化与mTOR磷酸化水平相反，当适宜浓度的雷帕霉素抑制mTOR磷酸化时，ALP、osterix和Runx2的表达明显增强，MHY1495能够促进mTOR磷酸化，从基因和蛋白水平降低ALP和osterix的表达，对Runx2无明显改变.

mTOR通过对各种骨相关细胞的活性、功能进行调控，从而影响骨代谢过程，其中涉及多种信号分子的调节，在骨组织代谢过程中起到重要作用.然而，研究显示mTOR磷酸化的抑制并不完全有利于骨量调节，接近极值的水平可能会影响细胞的基础功能，从而呈现相反的结果，且细胞生长、分化在不同阶段的自噬水平也不一致.本研究通过体外实验数据发现，适宜浓度的雷帕霉素能够通过抑制mTOR，增强成骨细胞的增殖活性和分化能力，而过度抑制或激活mTOR磷酸化则会诱导成骨细胞凋亡，减弱细胞分化功能.此外，有必要进行进一步的临床研究，以确认mTOR和骨质疏松症之间可能存在的关系，进一步研究未来预防和治疗骨质疏松症的治疗方法.