富半胱氨酸蛋白61对大鼠自体脂肪移植存活影响及其机制的实验研究

陈兆欢 段然 黄晓璐 李青峰

自体脂肪移植是整形与修复外科中一项重要且历史悠久的技术，主要用于填充治疗或组织修复再生治疗。近年随着脂肪来源干细胞（adipose derived stem cell，ADSC）被证实在自体脂肪移植中发挥脂肪形成、促进细胞外基质修复、促进血管化等作用[1-2]，自体脂肪移植技术的治疗范围进一步扩大，但同时其相关并发症诸如脂肪液化坏死、囊泡化、钙化、脂肪栓塞等日益增多[3-4]。与此同时，自体脂肪移植的保留率及最终填充体积无法预测，因此临床上常需要通过反复多次注射以达到满意的效果[5]。主流学说认为，移植脂肪细胞的存活主要依赖于其与供区细胞外基质之间新生血管的建立，获得有效血供支持的移植脂肪细胞能够存活并稳定存在[6]。临床试验也证实，在移植脂肪组织中添加ADSC可以通过促进新生血管化提高移植脂肪组织存活量[7]。

富 半 胱 氨 酸 蛋 白 61（cysteine rich protein 61，Cyr61）也称 CCN 家族成员 1（CCN family member 1，CCN1），是一种广泛存在于多种组织细胞中的基质信号调节蛋白，在细胞增殖、黏附、迁移、分化、血管新生、组织修复再生及炎症反应等病理生理过程中都发挥着重要的作用[8-17]，尤其在心血管系统中表现出广泛的生物学活性，通过与各种整合素受体（αvβ3、αvβ5等）相互作用参与新生血管的形成[14,18-19]。有研究显示，CCN1调控新生血管化的核心调节因子血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达[20]，证实了CCN1在新生血管化过程中起到关键作用。笔者团队在前期的研究中也证实了CCN1在创伤修复与组织再生领域具有促进血管新生的作用[13,21]，而CCN1在自体脂肪移植方面的研究与应用未见相关报道。

本研究旨在探讨CCN1对自体脂肪移植术后脂肪组织存活的影响，通过建立大鼠自体脂肪移植模型进行体内验证并通过高通量测序技术进行关键信号通路分析与靶点筛选，寻找可能的分子机制并进行后续基因及蛋白层面的验证，为临床工作提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

重组人 CCN1（recombinant human CCN1，rhCCN1）购于美国PeproTech公司，抗perilipin抗体和抗CD31抗体购于英国Abcam公司，荧光标记二抗购于 美 国 Thermo Fisher Scientific 公 司，PrimeScriptTMRT Reagent Kit和 TB Green Premix Ex TaqTM购于日本Takara公司，倒置荧光显微镜购于日本尼康公司。

1.2 实验动物

选取健康的6～8周龄，体质量240～260 g的雄性Wistar大鼠50只，购买并饲养于上海交通大学医学院附属第九人民医院动物实验中心。实验用大鼠均为无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级，于室温24～26 ℃，昼夜12 h明暗交替环境下，连续清洁饮水，灭菌饲料规律喂养。

1.3 模型的建立与分组

大鼠经10%水合氯醛腹腔麻醉（0.5 mL/100 g体质量），于腹股沟区逐层小心分离约2 mL脂肪组织，并将其反复剪碎成适宜移植的均匀细小颗粒状。参考文献[22]及前期预实验，选取皮下脂肪较少的大鼠上背部为自体脂肪移植受区，采取多点、多通道、多方向的方法缓慢注射1 mL脂肪呈一个集中的半球形隆起，移植脂肪质量为（0.889±0.017）g。

建立大鼠自体脂肪移植模型1周后，选取全身及背部移植脂肪组织状况良好的大鼠共40只，将其随机分为CCN1组和对照组，每组20只，分别于术后8 d起隔日原位注射给药，CCN1组大鼠给予200 μL浓度为2 μg/mL的rhCCN1，对照组给予200 μL无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS），为期2周。3个月后对移植脂肪组织进行取材。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪组织质量保留率计算 除去脂肪液化、囊泡化等不良结局的脂肪组织后，对健康的脂肪组织（其中实验组13个样本，对照组9个样本）测定其湿重并计算脂肪组织质量保留率（脂肪组织质量保留率=移植取材后组织湿重/移植前组织湿重）。

1.4.2 组织切片染色与评估 大鼠自体移植脂肪组织完整取材后浸泡于4%多聚甲醛48 h，后经梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片制成7 μm厚的石蜡切片并进行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。参考文献[23]，通过光学显微镜下观察移植脂肪组织HE切片，每个样本随机选择镜下5个视野并从脂肪细胞完整性、囊泡化与空泡化程度、炎症细胞聚集程度以及纤维化程度4个方面进行半定量评估移植脂肪组织的形态与活力。评估计分分别由两位医师执行，0～5分表示评价维度由低到高的程度。

1.4.3 免疫荧光染色 将石蜡切片置于二甲苯及梯度乙醇脱蜡复水，经抗原修复液处理后，用2%牛血清蛋白进行封闭。然后滴加抗perilipin抗体（1:200）和抗CD31抗体（1:200）分别标记活性脂肪细胞与新生血管内皮细胞，置于湿盒中4 ℃孵育过夜，用PBS漂洗3次后滴加对应二抗置于湿盒37 ℃孵育1 h。用PBS漂洗3次后，二氨基联苯胺显色并封片，置于荧光显微镜下观察。采用Image J软件对perilipin、CD31染色区域进行定量分析，分别计算活性脂肪细胞比例和新生血管数量。

1.4.4 总RNA提取和高通量测序 将大鼠移植脂肪组织小心剪碎成约2 mm×2 mm大小，使用Trizol进行总RNA提取。将-80 ℃保存的总RNA样本送至上海云序生物科技有限公司进行高通量测序和生物信息学分析，方法参考文献[24]。获得信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA） 的 表 达 谱后，计算两组样品间的倍数变化和P值，鉴定差异表达mRNA。利用差异表达mRNA进行基因本体数据库 （Gene Ontology，GO）功能分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析[24]。

1.4.5 实时荧光定量聚合酶链反应 应用PrimeScriptTMRT Reagent Kit和 TB Green Premix Ex TaqTM分别进行逆转录与实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）实验，方法参照试剂盒说明书。采用RT-qPCR检测自体移植脂肪组织血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、VEGF、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、IL-8和Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）2 mRNA的表达水平。

1.5 研究方法

比较两组大鼠移植脂肪的存活情况；比较两组大鼠移植脂肪组织形态、活性脂肪细胞比例及新生血管数量；利用高通量测序技术比较两组大鼠移植脂肪组织差异表达mRNA并进行聚类分析；比较两组大鼠自体脂肪移植术后相关促炎因子的表达水平。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，采用GraphPad Prism 6软件进行统计图绘制。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本的t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组大鼠自体移植脂肪的存活情况

在大鼠自体脂肪移植模型中，CCN1组大鼠移植脂肪组织质量保留率为（50±3）%，高于对照组的（35±4）%（P＜0.05，图1），表明大鼠自体移植脂肪存活率在CCN1干预下有较明显的提升。

图1 两组大鼠自体移植脂肪存活情况比较Figure 1 Comparison of the survival of autologous fat grafts of rats between two groups

2.2 两组大鼠自体移植脂肪组织的形态

光学显微镜下观察大鼠移植脂肪组织HE染色切片，从脂肪细胞完整性、囊泡化与空泡化程度、炎症细胞聚集程度以及纤维化程度4个角度评价移植脂肪组织的形态与活力（图2）。与对照组比较，CCN1组脂肪细胞完整性更高，囊泡化与空泡化程度、炎症细胞聚集程度和纤维化程度更低，差异均有统计学意义（均为 P＜0.000 1）。

图2 两组大鼠自体移植脂肪组织形态比较Figure 2 Comparison of morphology of autologous fat graft tissues of rats between two groups

2.3 两组大鼠自体移植脂肪组织的活性脂肪细胞比例

对脂肪组织切片进行免疫荧光染色，采用perilipin标记具有活性的脂肪细胞。CCN1组中活性脂肪细胞较多且形态均一、结构完整，对照组存在较少的活性脂肪细胞且大小不一，伴有囊泡化现象（图3A）。每个样本随机选取5个视野对perilipin染色面积比例进行统计比较，与对照组比较，CCN1组perilipin染色面积比例更高，差异有统计学意义[（7.9±1.9）% 比（10.2±2.1）%，P＜0.01，图 3B]，表明CCN1组活性脂肪细胞比例更高。

图3 两组大鼠自体移植脂肪组织中活性脂肪细胞比例比较Figure 3 Comparison of active adipocytes proportion in autologous fat graft tissues of rats between two groups

2.4 两组大鼠自体移植脂肪组织的新生血管数量

为进一步探究CCN1促进大鼠自体脂肪移植存活的机制是否与新生血管的增加有关，对脂肪组织切片进行免疫荧光染色，采用CD31标记新生血管内皮细胞（图4A）。每个样本随机选取10个视野对CD31阳性内皮细胞数量进行统计比较，CCN1组较对照组中CD31阳性的内皮细胞数量更多，差异有统计学意义 [（10.2±3.1）个比（6.9±1.9）个，P＜0.05，图4B]，提示CCN1组新生血管数量更多。

为进一步验证CCN1在移植脂肪组织中新生血管化的作用，通过RT-qPCR检测脂肪组织中PDGF、FGF和VEGF mRNA表达水平（图4C）。结果显示，与对照组比较，CCN1组PDGF和FGF mRNA水平均升高，差异均有统计学意义（均为P＜0.05），VEGF mRNA差异无统计学意义（P＞0.05）。

图4 两组大鼠自体移植脂肪组织新生血管数量比较Figure 4 Comparison of neovascular number of autologous fat graft tissues of rats between two groups

2.5 两组大鼠自体移植脂肪组织差异表达mRNA聚类分析

为探究CCN1影响大鼠自体脂肪移植存活的内在机制，本研究将CCN1组与对照组的大鼠自体移植脂肪组织提取总mRNA进行转录组高通量测序，并对测序结果进行分析。测序结果显示两组的mRNA表达水平差异有统计学意义，共鉴定出589个差异表达基因，包含315个上调基因和274个下调基因。其中与M1型巨噬细胞相关的细胞表面标志物[细胞因子信号传导抑制剂 3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）、TLR2、TLR7、TLR9、IL-18受体辅助蛋白（IL-18 receptor accessory protein，IL-18RAP）、炎症因子及趋化因子[IL-1β、肿瘤坏死因子-α诱导蛋白 3（tumor necrosis factor alpha induced protein 3，TNF-αIP3）、IL-23α、IL-6、IL-18、CC趋化因子配 体（CC chemokine ligand，CCL）3、CCL4、CXC趋化因子配体（CXC chemokine ligand，CXCL）1、CXCL2、CXCL6]基因表达均呈下调趋势（表1），提示CCN1干预可能抑制移植自体脂肪组织中的巨噬细胞表型向M1表型转化。

表1 高通量测序分析两组mRNA表达水平差异Table 1 High-throughput sequencing analysis of difference of mRNA expression levels between two groups

2.6 两组大鼠自体移植脂肪组织促炎因子的mRNA表达水平

为进一步验证高通量测序结果，采用RT-qPCR检测两组大鼠移植脂肪组织促炎因子的mRNA表达水平（图5）。与对照组比较，CCN1组IL-8、IL-1和TLR2 mRNA表达水平均降低，差异均有统计学意义（P＜0.01～0.05），IL-6 mRNA 表达水平略降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

图5 两组大鼠自体移植脂肪组织促炎因子mRNA表达水平比较Figure 5 Comparison of the mRNA expression levels of proinflammatory cytokines of autologous fat graft tissues of rats between two groups

3 讨 论

自体脂肪移植具有操作微创、来源丰富、移植物无排斥反应等优点，在临床上应用十分广泛，然而与此同时，移植物存活率低、术后常伴有囊肿、钙化等并发症一直是限制自体脂肪移植技术发展的关键因素[25]。自体脂肪移植物长期保留率较低主要由于移植术后早期脂肪组织处于缺血缺氧状态，导致大量脂肪细胞无法健康存活[26-27]。而近来主流学界发现，增加移植受区与脂肪组织间血管的建立、促进ADSC成脂分化能够有效提高移植脂肪保留率[28]。Toyserkani

等[29]比较传统自体脂肪移植与细胞辅助脂肪移植发现，在脂肪移植物中添加基质血管片段（stromal vascular fraction，SVF）能够明显提高移植脂肪受区毛细血管密度以及移植脂肪保留率。Li等[30]在353例隆乳病例中比较了传统自体脂肪移植与细胞辅助脂肪移植，发现细胞辅助脂肪移植能有效提高移植脂肪存活率。Kølle 等[7]则通过随机对照试验证实，添加ADSC辅助脂肪移植有效提高了移植脂肪保留率，术后4个月脂肪保留率可达80%。

SVF包含ADSC、血管内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞等成分，可以通过不同的方式促进移植脂肪早期血管化的建立[31]，从而提高移植脂肪的存活率。小鼠体内实验显示，ADSC可向血管内皮细胞和周细胞分化，两者协同形成血管网向移植脂肪内部生长，改善移植脂肪的缺血缺氧环境[32]。同时，ADSC分泌的VEGF可以活化内皮祖细胞，诱导内皮细胞表达整合素1、αvβ3、αvβ5及其配体，促进内皮细胞的增殖、迁移及新生血管的融合[33-34]。ADSC能够分泌前列腺素E2介导M2型巨噬细胞分化，进而分泌碱性FGF（basic FGF，bFGF）、VEGF等促血管生成因子，促进新生血管形成[35]。

TLR2作为TLR家族中的重要成员，在M2型和M1型巨噬细胞的相互转化中扮演着重要角色。M1型巨噬细胞一直被认为具有促炎作用，介导针对病原体的防御，并分泌促炎因子和诱导型一氧化氮合酶。已有研究表明，当巨噬细胞上的TLR2信号被活化后，细胞质内的核因子（nuclear factor，NF）-κB和活化蛋白（activating protein，AP）-1可向细胞核内转移，上调促炎基因的转录，促使M1型巨噬细胞极化的发生[36]。TLR2-/-的小鼠与野生型小鼠相比，其体内M2型巨噬细胞的数量显著增加，且抗炎因子IL-10的表达也呈现上调趋势，而M1型巨噬细胞数量显著降低，相应的促炎因子肿瘤坏死因子-α和IL-6的表达呈现下调趋势。以上研究均表明TLR2信号能够促进M1型巨噬细胞表型的极化，导致炎症因子分泌增多。结合本研究中高通量测序结果以及RT-qPCR结果，CCN1组较对照组TLR2基因表达水平显著降低，提示伴有M2型巨噬细胞极化发生，从而抑制炎症因子的分泌。

CCN1蛋白广泛存在于多种组织细胞中，并作为一种促血管生成因子，通过与各种整合素受体（αvβ3、αvβ5等）相互作用促进内皮细胞的黏附、增殖、迁移与血管形成[13,37]。小鼠体内实验证实，CCN1蛋白可以通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositol-3-kinase/ protein kinase B，PI3K/Akt）信号通路介导视网膜新生血管的形成[38]。Matsumae等[39]则在大鼠颈动脉球囊损伤模型中发现，敲低CCN1基因的表达能有效抑制颈动脉新生内膜的增生。

基于CCN1蛋白能够促进新生血管化的特点，本研究通过建立大鼠自体脂肪移植模型并外源性给予rhCCN1促进移植脂肪与受区之间早期的血供建立，保证脂肪细胞的存活，最终有效提高移植脂肪组织质量保留率。结果显示，CCN1组脂肪组织3个月后质量保留率高于对照组， HE染色可见CCN组脂肪组织形态更完整，脂肪细胞数量较多且排列整齐，炎症细胞聚集程度、囊泡化及纤维化程度都明显少于对照组，提示CCN1能有效提高自体脂肪移植的质量。免疫荧光染色可见CCN1组移植脂肪组织内有较多新生血管形成，明显多于对照组，说明CCN1促进了移植脂肪与受区之间、移植脂肪内部的新生血管化，为脂肪细胞的稳定存活提供营养与氧气支持，最终提高了移植脂肪的存活率。对血管化生长因子表达的检测结果显示，CCN1组PDGF、FGF表达水平较对照组明显升高，而VEGF表达差异无统计学意义，可能由于取材时间点为脂肪移植术后3个月，VEGF表达趋于平稳，有待于在后续的实验中增加移植术后早期的时间点进行补充验证。CCN1组与对照组二代测序结果对比显示，M1型巨噬细胞表面标志物表达水平较对照组降低，提示CCN1可能通过促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化从而促进新生血管化。通过对M1型巨噬细胞相关促炎因子及其标志物进行检测进一步证实了以上猜想，后续有待更深入的机制研究。

综上所述，在自体脂肪移植过程中添加外源性CCN1能有效促进脂肪组织新生血管化，提高移植脂肪存活率，其机制可能是通过下调TLR2表达介导巨噬细胞向M2型转化。本研究为临床工作中提高对脂肪移植术后效果的预测与判断提供新的思路和理论依据。