柠檬烯抑菌机理及其在果蔬保鲜中应用的研究进展

王佳宇，胡文忠,*，管玉格，于皎雪，赵曼如

（1.大连民族大学生命科学学院，辽宁大连 116600；2.大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁大连 116024）

微生物是引起果蔬腐败变质的主要原因，而使用防腐剂可以有效抑制致腐微生物生长，减缓新鲜果蔬腐败变质，提高其感官品质，延长货架期[1−2]。但是由于目前化学防腐剂的安全残留性问题已不能满足消费者对于食品安全的高要求，近年来经济、环保、高效的天然生物防腐剂逐渐成为果蔬保鲜领域的研究热点[3−4]。

柠檬烯（Limonene）又名苧烯，是一种单环单萜烯，可主要从橘皮精油、柑桔油、白（青）柠檬油、甜橙油、佛手油、柚子油以及榄香树脂等精油中提取[5−6]。柠檬烯具有良好的抑菌作用，可有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、黑曲霉菌以及鲁氏酵母等生长，且其安全性较高，于20世纪90年代已被世界卫生组织（WHO）报道为无致癌性、无遗传毒性。美国食用香料与提取物制造商协会认定其为一般公认安全级（Generally Recognized as Safe，GRAS），国际日用香精香料协会（Internatioal Fragrance Association，IFRA）不限定柠檬烯的用量，并已经过了美国食品药品局（Food and Drug Administration，FDA）的批准使用[7]。且有研究表明，柠檬烯被摄入机体后，大部分都可随汗液、尿液等排出，不会在体内积累对人体产生毒副作用，因此其近年来已被广泛应用于果蔬保鲜领域[8]。本文主要是对柠檬烯的抑菌作用及其在果蔬保鲜领域中的应用进行介绍，并讨论了其在今后的发展方向，以期为柠檬烯在果蔬以及其他食品保鲜应用中的进一步研究提供参考。

1 柠檬烯的结构、理化性质及功效作用

1.1 结构

柠檬烯化学名为1-甲基-4-异丙基环己烯，分子式为C10H16，分子量为163.24，主要以3 种构型的异构体形式存在，分别为L-柠檬烯、DL-柠檬烯和D-柠檬烯。在果蔬中柠檬烯主要以D-柠檬烯（即右旋柠檬烯）构型的异构体形式存在，其含量可占95%以上，而L-柠檬烯（左旋柠檬烯）和DL-柠檬烯（二聚异戊二烯）构型的异构体含量较低[9]。D-柠檬烯的分子结构式如图1所示[10]。

图1 D-柠檬烯分子结构Fig.1 Molecular structural formula of D-limonene

1.2 理化性质和功效作用

柠檬烯是一种具有类似于柠檬香气，呈无色或者淡黄色的油状液体，其不溶于水，易溶于乙酸乙酯、正己烷、乙醇以及丙酮等有机溶剂[11]。柠檬烯在光照、空气与水分条件存在下极易氧化为柠檬烯过氧化物，而柠檬烯过氧化物不稳定，会进一步转化为香芹酮、香芹醇等杂质，因此提取柠檬烯的过程要极其小心。而目前提取柠檬烯的方法主要有蒸馏法（又分为水蒸气蒸馏法、减压蒸馏法和分子蒸馏法）、有机溶剂浸提法、超临界CO2萃取法以及超声波辅助提取法等，其中，超临界CO2萃取法是目前比较理想的柠檬烯提取方法，可使柠檬烯的萃取得率达80%以上[12−13]。柠檬烯具有良好的生理活性与功效作用，如抗肿瘤[14−22]、抗氧化[23−24]、降低肝脏损伤[25]、缓解失眠与焦虑[26]、祛痰平喘以及利胆溶石[27]等。

2 柠檬烯的抑菌作用及抑菌机理

2.1 抑菌作用

食品在加工和贮藏过程中极易受大肠杆菌（Escherichia coil）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）以及苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）等细菌的污染，严重影响食品感官品质以及增加潜在的安全性问题[28]。而近年来国内外学者对于柠檬烯抗菌性的研究证明，柠檬烯可以有效地抑制细菌生长，如章斌等[29]为探讨尤力克柠檬果皮精油中柠檬烯的抑菌作用，结果发现其可以有效抑制大肠杆菌（Escherichia coil）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的生长，抑菌圈直径分别达（9.19±0.64）、（9.44±0.27）、（9.78±0.26）mm；冯堃等[30]使用牛津杯法同样证明柠檬烯可有效抑制大肠杆菌（Escherichia coil）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、四联球菌（Micrococcus tetragenus）以及枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的生长和繁殖，这与章斌等的实验结果基本一致。除此之外，柠檬烯同样还可对一些其他细菌起到抑制作用，详见表1所示[28]。

表1 柠檬烯对细菌的抑制作用Table 1 Inhibit effect of limonene on bacteria

柠檬烯的广谱抑菌性还体现在其对真菌也有一定的抑制作用，可有效抑制黑曲霉菌（Aspergillus niger）、黄曲霉菌（Aspergillus flavus）、鲁氏酵母（Saccharomyces rouxiiBoutroux）、串珠镰刀菌（Fusarium moniliformeSheld）以及啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等的生长，详见表2所示[28]。

表2 柠檬烯对真菌的抑制作用Table 2 Inhibit effect of limonene on fungus

2.2 抑菌机理

精油以其广谱的抑菌性、优良的抑菌活性以及安全无毒的优势，近年来在抑菌方面得到了广泛的关注，其中，普遍推测是由于微生物细胞膜与植物精油的疏水性成分相结合，从而导致微生物的结构被破坏，甚至死亡。Burt[42]系统地论述了精油的抑菌机理，并且陈述了植物精油对微生物细胞结构中的多个作用靶点，这些作用方式主要包括破坏细胞膜、降解细胞壁、破坏膜蛋白、凝结细胞质、损耗质子主动运输力以及使细胞内溶物渗出等，如图2所示[42−43]。

图2 精油对菌体细胞抑制作用的靶点[38-39]Fig.2 Locations in the microbial cell thought to be sites of action foressential oil[38-39]

近年来，国内外学者对于柠檬烯的抑菌机理进行了较长时间的深入研究，但同大部分的植物精油一样，目前对其抑菌机理还未有明确的结论，许多学者也在进一步探讨之中。微生物细胞壁是维持其外形、协助细胞运动、抑制渗透和机械损伤以及防止大分子入侵等生理功能的重要结构[44−45]，有研究表明微生物细胞壁是柠檬烯作用的首要靶点，其可以通过调控果胶甲酯酶（PEP）和纤维素酶（CAS）的活性，破坏细胞壁使其死亡；也有些学者认为柠檬烯可以通过干扰微生物菌体内正常的能量代谢途径，如破坏膜电位平衡、降低质子动力以及使三磷酸腺苷（ATP）合成受阻等，从而打破微生物代谢平衡使其死亡，而且柠檬烯在浓度为5×10−3mol/L 时即可起到抑制作用[46]；也有研究表明柠檬烯可通过作用于微生物的细胞膜，破坏其完整性，使细胞出现破裂、孔洞以及塌陷等现象，引起细胞内溶物外泄露出，从而导致细胞正常的生长繁殖受阻。此外研究学者还发现，柠檬烯除了以渗透作用进入细胞膜外，其还可以透过线粒体膜，从而使微生物菌体的细胞器和相同离子渗出过程中的渗透率增大[47]；除此之外，胡菲菲[48]探究酿酒酵母耐受D-柠檬烯胁迫的蛋白质组学分析得出，D-柠檬烯可使酿酒酵母细胞中具有调控细胞增殖分裂功能的Cpr1p 和DNA 修复能力的Rpt4p 下调，从而抑制酿酒酵母细胞增殖，这也为柠檬烯的抑菌机制提供了重要线索。

而在目前的研究中，柠檬烯通过作用于微生物细胞膜从而达到抑制其生长繁殖目的的抑菌机理得到了普遍认同。整个过程中，柠檬烯的疏水性可使其能够扩散通过磷脂双层膜，从而导致细胞膜中不饱和脂肪酸比例变化，细胞膜结构被改变，最终使微生物死亡，该抑菌机理也得到了许多学者的验证。如Pasqua 等[49]使用扫描电镜探究柠檬烯对金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌和嗜热甲烷八联球菌细胞膜的影响，研究发现，柠檬烯作用于受试菌后，能够引起细胞膜结构变化，且细胞膜中不饱和脂肪酸含量明显减少；Pasqua 等[50]也提出大肠杆菌O157:H7、葡萄球菌经柠檬烯作用后，经扫描电镜观察，发现上述微生物的细胞膜发生了明显的变化，且经测定同样发现细胞膜中不饱和脂肪酸含量明显下降；这在探究柠檬烯处理大肠杆菌、荧光假单胞菌以及铜绿假单胞菌等抑菌机理时也得到了相似结果[36−37]。

3 柠檬烯在果蔬保鲜中的应用

新鲜果蔬含有丰富的蛋白质、维生素以及多种人体必需的矿物质等营养成分，且热量低，因此广受消费者的青睐[51−52]。然而大多数新鲜果蔬由于在采摘、运输、贮藏以及销售过程中受到的机械损伤，极易遭受微生物侵染，而微生物是导致果蔬发生腐败变质最主要因素之一。虽然果蔬内含有次生代谢产物可暂时抵御微生物的生长，但微生物可通过产生毒性化合物或者以发酵的方式逐渐改变果蔬内的环境以达到其生存的目的，从而造成果蔬营养成分流失、感官品质下降，并引发一系列潜在的食品安全问题[53−54]。研究发现将柠檬烯单独处理或与其他制剂复配处理新鲜果蔬后，均可有效达到抑制微生物生长、保留新鲜果蔬营养成分以及提高感官品质的作用。

3.1 单独柠檬烯处理

由于柠檬烯自身溶解度较低，因此在果蔬保鲜应用中为提高柠檬烯溶解度需要提前将其乳化，而目前大多数研究的乳化方法为柠檬烯:蛋黄卵磷脂=25:2 混合处理。研究发现青椒经柠檬烯乳化液处理后，对其腐烂有明显的抑制作用，可将腐烂率降低30%，并且其也可以降低青椒相对电导率，减缓细胞膜透性，从而保护青椒细胞膜系统，将细胞膜损伤程度降低2.103 倍[55]；赵菊莲等[56]同样探究柠檬烯乳化液对杏果实的保鲜效果，研究发现该处理可使杏果实表面形成一层保护膜，延缓其在贮藏期间呼吸作用、能量代谢等生理活动，同时还可有效抑制致腐微生物入侵，降低杏果实腐败变质的发生；除此之外，学者们研究发现使用柠檬烯乳化液处理油桃[57]、草莓[58]和菠菜[59]后，其也可以有效减缓上述果蔬维生素C、可溶性固形物以及可滴定酸的分解与消耗，提高油桃、草莓和菠菜在贮藏期间的营养价值与商品价值，延长货架期。

3.2 复合柠檬烯处理

近年来，一些学者还重点研究了柠檬烯与其它制剂联合使用的果蔬保鲜技术。研究发现使用壳聚糖-柠檬烯涂膜与气调贮藏（初始浓度：10% O2+CO2）相结合的方法对黄瓜进行保鲜，可保持黄瓜在贮藏期间的失重率、硬度、pH、色泽、玻璃化转变温度等指标，并且还可以通过抑制酵母菌和霉菌的生长繁殖来延缓黄瓜腐败变质的发生，延长其货架期[60]；此外，学者们还研究发现用含有柠檬烯的可食性涂膜处理草莓同样可以有效抑制酵母菌和霉菌的生长，并且还可以通过调控合成花青素途径中的关键酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，使草莓维持较高的花青素含量（43.849 mg/100 g），从而保持草莓鲜红的色泽[61−62]；在芒果保鲜上，使用聚乙烯醇、壳聚糖和柠檬烯制成的包装膜可有效抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长，使抑菌圈直径分别为（6.61±0.04）和（6.88±0.02）mm，将芒果在贮藏期间的腐烂率降低至20%以下[63]，有效延缓了腐烂变质的发生。

综上，柠檬烯作为一种从橘皮精油中提取的天然、高效、安全的生物防腐剂已在一些果蔬保鲜应用中取得了良好的效果，其在鲜切果蔬保鲜及其他食品保鲜行业也具有重要的应用发展前景。

4 展望

柠檬烯作为一种优良的天然植物精油，因具有广谱的抑菌性，且安全性可靠已被广泛应用于食品保鲜、医药、农药等领域，在市场上的应用前景非常广阔。但是目前国内外对其抑菌机理的研究尚不明晰，对果蔬保鲜种类研究也较少，因此，今后可以着重探究柠檬烯的抑菌机理，以及增加柠檬烯对其他果蔬保鲜效果的研究，为其商业应用奠定理论基础。