4种猪绦虫蚴的多重PCR鉴别

陈国梁，郭爱民，张少华，梁盼红，李艳萍，王立群，刘婷丽，白 雪，骆学农

绦虫是一类具有复杂生活史的寄生虫，其幼虫(绦虫蚴)不仅严重危害猪、牛、羊等动物的健康，造成养殖业的经济损失，而且很多都是人兽共患寄生虫病，对人类健康也构成潜在威胁。猪囊尾蚴病(Cysticercosis cellulosae)是由猪带绦虫(Taeniasolium)的中绦期幼虫-囊尾蚴(Cysticercuscellulosae)寄生于人和猪引起的一种严重危害人类健康和畜牧业生产的人兽共患寄生虫病。该病呈全球性分布，主要流行于亚、非、拉等一些国家和地区，其中以中非、南非、中南美等地区最为严重[1-2]。全球每年约有5 000万人感染猪带绦虫或猪囊尾蚴，约有5万人死于脑囊尾蚴(囊虫)病[3]。猪带绦虫病和囊虫病互为因果，形成人-猪相互传播，恶性循环，已成为重要的公共卫生问题。虽然可以通过改善公共卫生、加强动物的饲养管理、严格肉品检疫来控制该病的发生，但无论是人的猪带绦虫病还是猪和人的囊尾蚴病，都没有特异、敏感的血清学诊断方法，其诊断的金标准仍然是病原学检查。因此，剖检仍然是目前猪肉检疫中猪囊尾蚴病诊断的金标准。

猪带绦虫(Taeniasolium)、亚洲带绦虫(Taeniaasiatica)、细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)和泡状带绦虫(Taeniahydatigena)的幼虫(绦虫蚴)常寄生于猪的肌肉或肝脏等内脏器官。猪囊尾蚴(C.cellulosae)主要寄生于猪的肌肉、肝脏和大脑[4]，而亚洲带绦虫囊尾蚴除可寄生于肌肉外，与细粒棘球蚴和细颈囊尾蚴一样，主要寄生于猪的肝脏等内脏器官。由于囊尾蚴和棘球蚴均为包囊性结构，在包囊很小时，很难通过肉眼进行区分，尤其是猪囊尾蚴、亚洲带绦虫囊尾蚴和细颈囊尾蚴都具有1个头节，头节上有顶突和小钩，常规的头节压片镜检也难于准确鉴定[5]。因此，基于DNA片段的分子诊断是目前猪带绦虫/囊尾蚴鉴别诊断必不可少的技术手段[6-8]。

多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction, mPCR)是一种可在同一体系中同时扩增多个核酸片段的PCR方法，可直接通过PCR产物电泳条带大小或PCR产物的序列分析对不同虫种进行鉴别[9]。本试验拟建立一种可以同时鉴别猪囊尾蚴等4种猪绦虫蚴的mPCR检测方法，对猪囊尾蚴病的流行病学调查、追踪溯源及保障食品安全和人类健康具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 虫体 猪囊尾蚴、亚洲带绦虫囊尾蚴、细粒棘球蚴、细颈囊尾蚴均由兰州兽医研究所家畜寄生虫实验室人工感染猪后剖检收集或临床收集保存。

1.1.2 主要试剂及仪器 胶回收试剂盒、DNA提取试剂盒均购自Axygen公司，pMDTM19-T vector Cloning Kit购自TaKaRa公司，2×Taq Master Mix和Fast-T1化学感受态细胞购自Vazyme公司。主要仪器有超速离心机(Thermo)、PCR仪(Bio-Rad)、电泳仪(Bio-Rad)、凝胶成像系统(Bio-Rad)、电热恒温培养箱(DHP-9052型)等。

1.2 方 法

1.2.1 基因组DNA的提取 从-80 ℃冰箱分别取出4种绦虫幼虫(亚洲带绦虫囊尾蚴、细粒棘球蚴、细颈囊尾蚴和猪囊尾蚴)，室温解冻后用去离子水洗干净，分别置于研钵中，加入液氮快速研磨至粉状；以未感染囊尾蚴的猪肝脏作为阴性对照，按照试剂盒说明书分别提取每种虫体和肝脏的基因组DNA，-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物设计及合成 从GenBank中下载4种绦虫线粒体基因组序列，并用DNAMAN进行比对分析。参考Jeon等[10-11]的文章，以tRNA-Val、tRNA-Ala、tRNA-Asp和nad1基因为mPCR扩增的目标基因，用Oligo软件分析比较，筛选出最优的4种绦虫特异性上游引物和1条通用下游引物序列(图1)。引物由西安擎科生物公司合成(表1)，使用前分别稀释至10 pmol/μL。

图1 4种绦虫蚴线粒体部分序列比对及特异性引物结合位点Fig.1 Sequence alignment and specific primer binding sites for the partial mitochondrial genome sequence of four tapeworm metacestodes

表1 PCR引物设计Tab.1 Design of PCR primers

1.2.3 4种猪绦虫蚴PCR方法的建立 取亚洲带绦虫囊尾蚴、细粒棘球蚴、细颈囊尾蚴、猪囊尾蚴和猪肝脏的基因组DNA模板各0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，加ddH2O补足至25 μL，混合均匀后进行PCR反应。PCR反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共进行35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，分析PCR扩增产物的特异性，评价4种绦虫蚴引物的特异性。

1.2.4 4种绦虫蚴mPCR方法的建立 分别以0.5 μL亚洲带绦虫囊尾蚴、细粒棘球蚴、细颈囊尾蚴、猪囊尾蚴及猪肝脏的基因组DNA为模板，4种绦虫蚴特异性引物(TaF、EgF、ThF和TsF)的等量混合物(2 μL)为上游引物，通用引物(TR，2 μL)为下游引物，加入2×Taq Master Mix 12.5 μL，并加ddH2O至25 μL。与1.2.3相同条件下进行PCR扩增，评价引物混合后各个片段扩增的特异性。

1.2.5 mPCR方法的特异性 采用优化后的PCR反应体系及扩增程序，分别取亚洲带绦虫囊尾蚴、细粒棘球蚴、细颈囊尾蚴、猪囊尾蚴各2种、3种和4种DNA等量混合，分别以混合DNA为模板，用混合引物进行mPCR扩增，评价不同DNA混合物对PCR产物特异性的影响。同时，用猪肝脏DNA和混合引物进行的mPCR作为阴性对照。

1.2.6 临床样品的鉴别 取实验室保存的临床收集或人工感染的12份来自猪的绦虫蚴样品，分别提取基因组DNA，用mPCR对12份样品进行鉴别。

1.2.7 mPCR扩增序列的验证 取4种绦虫蚴PCR扩增产物(710 bp、619 bp、542 bp和478 bp)，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳。用胶回收试剂盒纯化的PCR产物分别与pMDTM19-T连接，转化大肠杆菌Fast-T1感受态细胞，在含氨苄青霉素(终浓度为100 μg/mL)、X-gal(终浓度为4 mg/mL)和IPTG(终浓度为0.1 mmol/L)的LB平板上37 ℃培养14～16 h，挑白色单克隆菌落扩大培养，经PCR鉴定后送西安擎科生物公司测序。

2 结 果

2.1 PCR引物的确定 4种绦虫特异性上游引物(TaF、EgF、ThF和TsF)分别与下游通用引物(TR)进行PCR扩增，获得的目的片段大小分别为710 bp(亚洲带绦虫囊尾蚴)、619 bp(细粒棘球蚴)、542 bp(细颈囊尾蚴)和478 bp(猪囊尾蚴)，而阴性对照没有扩增出任何条带(如图2)，说明所设计的上游引物(EgF、TaF、ThF和TsF)是种特异性的，可对目标虫体的DNA进行有效扩增。其PCR扩增条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共进行35个循环，72 ℃延伸5 min。

M为DNA Marker DL1000；1为亚洲带绦虫囊尾蚴；2为细粒棘球绦虫；3为细颈囊尾蚴；4为猪囊尾蚴；5为阴性对照图2 4种绦虫蚴的PCR扩增Fig.2 PCR amplification of four metacestodes

2.2 mPCR方法的建立 4种绦虫蚴特异性上游引物混合液(EgF、TaF、ThF和TsF)结合下游引物(TR)，也分别扩增出了预期大小的片段(710 bp、619 bp、542 bp、478 bp)，而阴性对照没有扩增出任何条带(如图3)，说明4组引物混合后，彼此间不存在相互影响，在同一反应体系中扩增出各自对应的目的片段。

M为DNA Marker DL1000；1为亚洲带绦虫囊尾蚴；2为细粒棘球绦虫；3为细颈囊尾蚴；4为猪囊尾蚴；5为阴性对照图3 4种绦虫蚴的mPCR扩增Fig.3 Multiplex PCR amplification of four metacestodes

2.3 mPCR特异性分析 将4种绦虫蚴基因组DNA每2种、3种和4种混合后作为模板，用4种特异性上游引物混合液(EgF、TaF、ThF和TsF)结合下游通用引物(TR)可分别扩增出4种绦虫特异性片段(图4)，说明4种绦虫种特异性引物的特异性不受其他种DNA的干扰。

2.4 临床样品检测 用已建立的mPCR方法，对12份临床疑似绦虫蚴样品进行了鉴定。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明(图4)，待鉴定的12份样品中分别扩增出478 bp(猪囊尾蚴)片段1份、710 bp(亚洲带绦虫囊尾蚴)片段3份、542 bp(细颈囊尾蚴)片段3份、619 bp(细粒棘球蚴)片段5份，而阴性对照样品没有扩出任何条带，说明12份样品中有1份猪囊尾蚴、3份亚洲带绦虫囊尾蚴、3份细颈囊尾蚴和5份细粒棘球蚴，而且mPCR结果与各个绦虫蚴的特异性引物所做的PCR结果相一致。表明所建立的mPCR方法可根据扩增片段的大小对猪的4种绦虫蚴进行鉴定。

M为DNA Marker DL1000；1为4种绦虫蚴DNA混合样品的阳性对照；2为阴性对照；3,5,13为亚洲带绦虫囊尾蚴；4,7,8,10,12为细粒棘球绦虫；9,11,14为细颈囊尾蚴；6为猪囊尾蚴图4 12份绦虫蚴DNA样品的mPCR鉴定Fig.4 Multiplex PCR identification of 12 metacestode DNA samples

2.5 PCR扩增片段测序分析 PCR产物测序表明，亚洲带绦虫囊尾蚴、细粒棘球蚴、细颈囊尾蚴、猪囊尾蚴的扩增片段大小分别为710、619、542 和478 bp，其序列与NCBI同源序列的一致性达99%以上，说明PCR扩增的各个绦虫蚴的片段即为设计的目的DNA片段。

3 讨 论

李彦采用mPCR技术扩增了人源3种绦虫HDP2基因序列，猪带绦虫、亚洲带绦虫分别扩增出约150 bp和599 bp的条带，而牛带绦虫则扩增出 150 bp 和 599 bp 的2条带，从而根据PCR条带的大小和带数建立了区分人源3种绦虫的mPCR方法[12]。Jeon等[10]采用mPCR技术扩增3种人源绦虫的tRNA-Val、tRNA-Ala、tRNA-Asp和nad1基因，扩增猪带绦虫(T.solium)、牛带绦虫(T.saginata)和亚洲带绦虫(T.asiatica)的基因分别产生478 bp、628 bp和710 bp的单一条带；应用该方法检测粪便中的虫卵，检测限为10 枚虫卵/1克粪便。以上2种方法已被应用于3种人源绦虫的鉴别诊断。

González[13]应用基于HDP2 基因片段的mPCR和rDNA内转录间隔区(ITS1和ITS2)的PCR-RFLP方法，可成功区分牛带绦虫囊尾蚴、猪囊尾蚴、细颈囊尾蚴和细粒棘球蚴。本研究中建立的4种猪源囊尾蚴mPCR方法较González的方法简单、省时、高效。笔者用DNAMAN对来自猪的4种绦虫蚴：猪囊尾蚴、亚洲带绦虫囊尾蚴、细粒棘球蚴和细颈囊尾蚴的线粒体基因组进行了比对分析，以tRNA-Val、tRNA-Ala、tRNA-Asp和nad1基因为靶标，设计了4条种特异性上游引物和1条通用下游引物。其中，针对亚洲带绦虫囊尾蚴、猪囊尾蚴的特异性引物较Jeon等设计的引物分别少3个碱基和1个碱基。因为Oligo分析显示，Jeon等设计的引物与细粒棘球蚴和细颈囊尾蚴有较高的错配率，从而导致PCR反应的特异性较差。

本研究设计引物的靶基因与Jeon等[10]的完全相同，并且引物部分结合位点也相同，但特异性大大提高。如果用该引物进行亚洲带绦虫和猪带绦虫鉴别诊断，推测其敏感性接近甚至超过Jeon等所建方法的检测限(10枚虫卵/1g粪便)。但由于并未采集到绦虫患者的新鲜粪便，未进行粪便中的虫卵检测试验和敏感性试验，所以本研究中mPCR的敏感性不确定。我们认为，该方法能够有效的区分猪囊尾蚴、亚洲带绦虫囊尾蚴、细粒棘球蚴和细颈囊尾蚴，在临床猪囊尾蚴病检验中具有重要意义，尤其在猪肝脏寄生绦虫蚴时，一定要将与猪囊尾蚴大小相近的亚洲带绦虫囊尾蚴和细颈囊尾蚴的进行鉴别诊断。因为三者间只是大小不同，一旦大小相近即使头节压片显微镜检查也很难准确鉴定。

当然，本研究所建立的mPCR方法，只能用于猪剖检后囊尾蚴病的辅助诊断。如果用PCR方法能检测猪血清样品中囊尾蚴的循环DNA，进行猪囊尾蚴病的生前分子诊断，那这种mPCR方法将具有更大的实用性和现实意义。因为目前猪囊尾蚴病的生前诊断主要依赖于血清抗体或抗原检测，这些血清学检测方法(如ELISA)往往在不同绦虫蚴间，甚至不同蠕虫间存在交叉反应。而分子诊断即使靶基因有几个碱基的差异，也可以通过检测血清中的DNA进行寄生虫的种间鉴别。越来越多学者开始探索建立从血清中检测绦虫DNA来检测绦虫蚴感染的方法。Ramahefarisoa等比较了用ELISA检测抗体和针对线粒体细胞色素氧化酶基因(COI)的血清PCR方法，认为PCR检测的特异性高，建议将其用于猪带绦虫囊尾蚴病确诊[14]。但Galán-Puchades等通过NCBI/BLAST和ClustalW进行的生物信息学分析发现，不同带绦虫种线粒体细胞色素氧化酶基因的同源性高，认为Ramahefarisoa等人获得的结果可能只能证明带绦虫幼虫(蚴)的存在[15]。如果将我们建立的mPCR方法用于血清DNA的检测，理论上可实现对猪囊尾蚴病的生前鉴别诊断。目前，我们正在进行猪囊尾蚴病血清中DNA的mPCR的检测工作。

利益冲突：无