烟草环斑病毒RT－PCR检测体系的优化

郇晓雪，刘晓宇*，房乐，杜传印，李广强，耿超，李向东，田延平

（1.山东农业大学植物保护学院，山东 泰安 271018；2.山东潍坊烟草公司，山东 潍坊 261061；3.枣庄市农业农村事业发展中心，山东 枣庄 277899）

烟草环斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）是豇豆花叶病毒科（Comoviridae）线虫传多面体病毒属（Nepovirus）代表种［1，2］，1927年首次发现于美国。目前TRSV已在50多个国家发生，是我国公布的二类进境检疫有害生物［3］。其粒子为球形，基因组含两条线形正义ssRNA，其中RNA1编码复制酶，RNA2编码运动蛋白（MP）和外壳蛋白（CP）［4，5］。

TRSV寄主范围广泛，能够侵染大豆（Glycine max）、马铃薯（Solanum tuberosum）以及烟草（Nicotiana tabacum）等54科300多种植物［6－9］，可通过种子、嫁接以及介体传播。TRSV的传播介体包括美洲剑线虫（Xiphinema americanum）［10－12］、烟蓟马（Thrips tabaci）、烟草跳甲（Epitrix hirtipennis）、蚜虫（Myzus persicae）等［13－15］。张满良等［16］报道了TRSV在渭北地区烟草上的危害，证明该病毒可通过蚜虫和种子传播，但不同烟草品种的种子带毒率有差异。种子和无性繁殖材料是TRSV远距离传播的重要方式［17］。2003—2008年我国2次在进口大豆中检测到TRSV［18］。2007年闻伟刚等［19］从美国进口大豆中检测到TRSV。2009、2010年文朝慧等［20，21］分别在荷兰萝卜种子和番茄种子中检测到TRSV。

TRSV的准确检测是对检疫工作的一项挑战。血清学方法和RT－PCR方法是鉴定该病毒的重要手段［22］。但血清学检测存在一定的不足，虽然绝大多数TRSV分离物具有相同的血清学关系，但发现至少存在4种具有不同血清学关系的株系，而且TRSV与该属亚组的马铃薯黑环斑病毒存在血清学相关性［14］。IC－RT－PCR结合了血清学和RT－PCR技术优点，但血清学上的交叉反应和潜在的错检漏检也给TRSV准确检测带来隐患。李桂芬等［23］研制的DAS－ELISA试剂盒检测纯化病毒灵敏度为15.625 ng／mL。对种子等病毒含量低的植物材料，利用该方法可能存在漏检情况。烟草种子可携带TRSV，但利用ELISA方法不能准确检测出种子带毒情况［16］。

RT－PCR是检测植物病毒应用最为广泛的方法之一，在新发病毒或无特异性抗体的病毒检测中的作用尤为突出。杨翠云等［24］利用胶体金免疫层析试纸结合RT－PCR方法建立了TRSV检测方法，灵敏度与DAS－ELISA类似。魏梅生等［25］建立了磁免疫层析试纸条方法检测TRSV，检测提纯病毒灵敏度为1μg／mL。杨伟东［26，27］、郑耘［28］等建立的基于RT－Realtime PCR、IC－RTRealtime PCR以及DB－RT－Realtime PCR检测方法，灵敏度分别为0.5 ng、25 ng和2 500 ng叶组织。易汪雪等［29］建立了单管实时荧光RTPCR，可检测到的大豆种子中的TRSV浓度为0.35 pg／mL。应淑敏、张吉红［30，31］等利用LAMP检测TRSV，灵敏度为普通RT－PCR的10倍。郭立新等［32］研究发现RT－LAMP检测灵敏度与常规RT－PCR技术灵敏度相当。以上表明引物的特异性、扩增条件等因素影响扩增结果的准确性和灵敏度。

建立高灵敏度和特异性的检测体系是防控TRSV的重要保障。该技术在新冠病毒核酸检测筛选新冠病毒阳性患者过程中起了举足轻重的作用［33］。本研究对引物特异性、退火温度及dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶浓度等条件进行优化，以期建立针对TRSV的RT－PCR检测体系，为准确、灵敏检测TRSV提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物为携带烟草环斑病毒的普通烟株，在温室中培养。温度为22℃，光照16 h，黑暗8 h。

1.2 RT－PCR引物设计

NCBI（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）上获取目前已知的全部烟草环斑病毒共20个全基因组序列（截至2021年1月17日），利用DNAMAN软件进行序列分析，获得烟草环斑病毒基因组中保守区域，在序列保守区域内利用软件Primer Premier 6.0设计特异性引物［34］（表1）。

表1 本研究所用引物

1.3 植物总RNA提取和反转录

将新鲜或超低温保存的携带烟草环斑病毒的烟草叶片样品迅速转移至液氮预冷的研钵内，充分研磨后转移至预冷的2.0 mL离心管中，加入1.0 mL TransZol（TransGen Biotech），具体提取步骤参考TransZol说明书。提取的RNA 保存－80℃备用。

利用Scandrop仪器测定RNA浓度：取500 ng植物总RNA，移至RNase free PCR管中，加入50 ng随机引物，加水至10μL，70℃条件下变性10 min后迅速在冰上静置2 min。在上述PCR管中加入4μL 5×M－MLV Buffer（TaKaRa），1μL 10 mmol／L dNTPs，0.5μL RNase Inhibitor（TaKa-Ra），0.5μL RTase M－MLV，4μL RNase free ddH2O。30℃预处理10 min后，42℃反应1 h，75℃10 min终止反应，获得的cDNA用于后期PCR扩增。

1.4 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增

PCR扩增体系：10×PCR Buffer 2.0μL、dNTPs（2.5 mmol／L）1.0μL、F引物0.5μL、R引物0.5μL、Taq DNA聚合酶（TaKaRa）0.3μL、模板cDNA 1.0μL，ddH2O补齐到20μL。PCR程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，退火30 s（退火温度参考表1），72℃延伸40 s，30个循环；72℃延伸7 min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳（120 V 30 min），溴化乙锭（EB）染色，凝胶成像系统观测电泳结果并拍照保存。

1.5 扩增条件优化和灵敏度检测

为了获得最佳的扩增效果，依次对退火温度和dNTPs、引物以及Taq DNA聚合酶最佳工作浓度进行优化。退火温度设置成8个梯度：45、46、48、51、53、55、58、60℃；在获得最佳退火温度的基础上，对dNTPs工作浓度进行优化，设置10个dNTPs浓度梯度：0.010、0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.175、0.200、0.225 mmol／L；进一步将引物终浓度设置成7个梯度：0.03、0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50μmol／L；在以上优化的PCR条件基础上，将Taq DNA聚合酶终浓度设置成10个梯度：0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050、0.055 U／μL，最终获得最优的扩增条件。

在灵敏度试验过程中，利用超微量分光光度计（Scandrop）测定提取的病叶总RNA浓度，分别取1 200.00、300.00、90.00、30.00、9.00、3.00、0.90、0.30、0.09 ng和0.03 ng植物总RNA进行反转录，反转录总体系为10μL。利用优化后的条件进行灵敏度检测。

2 结果与分析

2.1 特异性引物的筛选

针对TRSV基因组的保守区域，设计6对特异性引物，以感病植株cDNA为模板分别进行PCR扩增。结果表明，6对特异性引物都能从感染TRSV的病株中扩增出特异性目的条带，不同引物对的扩增结果差异明显（图1）。1－1F／1－1R引物末端保守性高，且GC含量相对较低，非特异性结合少，所以选择扩增结果相对较好的1－1F／1－1R进行后续试验。

2.2 RT－PCR检测体系建立和优化

对退火温度进行优化的结果（图2A）表明，在设定的温度范围内，引物对1－1F／1－1R均能扩增出特异性目的条带，表明引物具有较好的特异性，退火温度对扩增影响不大，后续研究选择53℃。

对dNTPs浓度进行优化的结果（图2B）表明，不同dNTPs浓度下均能扩增出特异性目的条带，但在大于0.075 mmol／L时，扩增效果最佳。

对引物终浓度进行优化的结果（图2C）表明，当引物终浓度小于0.20μmol／L或大于0.30 μmol／L时出现微弱的非特异性条带，引物终浓度为0.30μmol／L时扩增效果最佳。

对Taq DNA聚合酶终浓度进行优化的结果（图2D）表明，当Taq DNA聚合酶终浓度大于0.035 U／μL时，均具有较好的扩增效果。

图2 RT－PCR检测体系的建立和优化

根据筛选获得的条件，最终将扩增条件确定为退火温度53℃、dNTPs终浓度为0.075mmol／L、引物终浓度为0.30μmol／L、Taq DNA聚合酶终浓度为0.035 U／μL。

2.3 RT－PCR检测体系灵敏度测定

分别取反转录产物1.0μL（起始植物总RNA量的1／10）进行PCR扩增。结果表明，当TRSV病毒RNA总量大于等于0.090 ng时，引物对1－1F／1－1R可检测出TRSV（图3）。

图3 TRSV RT－PCR检测体系灵敏度测定

3 讨论与结论

本研究设计了不同特异性引物对，并优化了TRSV的RT－PCR检测体系。结果表明，针对TRSV基因组RNA1设计的特异性引物对1－1F／1－1R扩增效果最佳。在退火温度53℃、dNTPs终浓度0.075 mmol／L、引物终浓度0.30μmol／L、Taq DNA聚合酶终浓度0.035 U／μL时扩增效果最佳。感病植物总RNA量为0.090 ng时仍可检测到TRSV，表明优化后的检测体系具有较高的灵敏度。

通过对反应体系中引物、扩增条件等的优化，可以显著提高检测的灵敏度。闫志勇等［35］构建的RT－PCR体系能够从50 ng植物叶片（0.05 ng病毒RNA）中成功扩增到目的片段。本研究建立的检测体系能够从0.090 ng植物总RNA中检测到TRSV目的片段，具有很好的灵敏度和特异性。研究结果对准确灵敏地检测TRSV和切断病毒传播途径具有重要意义。