蚯蚓粪对槟榔根围土壤微生物多样性的影响

马思远，王海花，林雨彬，曾若菡，刁晓平,3，李 鹏

（1. 海南师范大学 生命科学学院，海口 571158; 2. 海南大学 生态与环境学院，海口 570228;3. 海南大学 南海海洋资源利用国家重点实验室，海口 570228）

槟榔（Areca catechuL.）属棕榈科多年生常绿乔木，是热带珍贵药用植物，为四大南药之首。海南是我国槟榔的主产区，全省槟榔种植面积约为102 530 hm2，产量约255 114 t，占全国产量的95%以上，主要分布于万宁市（18 138 hm2）、琼海市（16 311 hm2）、琼中县（12 447 hm2）、屯昌县（11 092 hm2）、定安县（8 917 hm2）和保亭县（6 685 hm2）[1]。目前，海南约有230万农民从事槟榔种植，槟榔已经成为海南农民重要的经济来源。海南槟榔产业年产值超过百亿元，已经成为海南省重要的支柱产业[1]，但在槟榔种植规模迅速扩大的同时，槟榔黄化现象对海南省槟榔产业造成了严重的威胁。据初步调查，海南省已有上万亩槟榔树出现了黄化现象，导致植株挂果严重减少，发病严重的植株会逐渐枯死，且槟榔黄化呈现逐年加重的趋势，给槟榔产业造成了巨大损失[2]。关于槟榔黄化的病因，有报道认为导致槟榔黄化的原因主要包括类细菌和类菌原体[3]，后来在海南槟榔黄化病病株的叶脉、叶鞘基部发现植原体[4]，且也有报道认为椰心叶甲、介壳虫、棕榈长翅蜡蝉、飞虱等害虫的危害也会导致黄化的发生；此外，栽培不当也会导致槟榔黄化病的发生，如使用化肥、除草剂和其他用药不当等[5]。目前，治疗槟榔黄化尚无非常有效的防治方法，仍采用挖出病株并烧毁，或使用广谱性的杀菌剂等方法，但效果均不理想。

生物有机肥往往通过功能微生物的大量繁殖，改变了土壤微生物群落结构进而对植物根系形成保护和促生作用[6]，且根系分泌物介导下的植物－微生物互作关系变化对于土壤肥力、健康状况以及植物生长发育有着极其重要的作用[7]。因此，在植物生长发育过程中，根系周围的微生物类群显著影响着植物对土壤中养分、重金属的吸收和转运、作物根际微生物种群的结构等[8]；一些有害微生物也会对作物的生长产生抑制作用，影响其生长发育[9]。蚯蚓粪是蚯蚓的代谢物，在种植业上应用价值较大。蚯蚓粪本身具有速效、长效、抗病、改良土壤和抗板结作用[10]，而且其中的功能微生物还可以不断将土壤中作物难以吸收的养分转化为易吸收的形态[11]，提高养分利用率，从而提高农作物产量、改善产品品质[12]，目前蚯蚓粪已得到了广泛的应用并取得了很好的效果。

由于目前对于槟榔根系微生物组的研究报道较少，且蚯蚓粪缓解槟榔黄化的机制有待进一步解析，本研究拟通过高通量测序技术比较施用蚯蚓粪前后槟榔跟围土微生物多样性的变化，并结合分析其与土壤理化性质的相关性分析，探究蚯蚓粪对槟榔园土壤微生物多样性以及互作网络的影响，旨在找出施加蚯蚓粪组、蚯蚓粪和化肥组与对照组的差别，揭示改善槟榔黄化现象的机制。

1 材料与方法

1.1 实验设计研究选取万宁龙滚槟榔种植园为实验区，在根系设置蚯蚓粪、蚯蚓粪和化肥、无任何添加共3种处理，10个月后进行采样，比较分析施加后3种处理下的土壤细菌和真菌多样性变化、微生物多样性和土壤理化性质的关联分析，并比较了3种处理下的微生物互作网络。蚯蚓粪来自三亚鑫苑农业科技发展有限公司。全氮、全磷和全钾含量≥5%，有益活菌≥0.2亿个·g-1，有机质含量≥20%，pH7.0。

2019年1月中旬进行蚯蚓粪以及化肥的施加，在示范地选取3块长势一致的槟榔种植园，槟榔树龄均为10 a，分别对每棵摈榔树施加蚯蚓粪（10 kg）、施蚯蚓粪和化肥（10 kg）、不作任何处理的区域。在两棵相邻槟榔树中间挖10 cm2×50 cm2左右的方形壕沟，分别进行上述3种处理。施肥10个月后取样，在3块区域中分别划分4块小区域，每块小区域选取3棵槟榔树，取地下10 cm左右、施肥附近的土壤，每份样品约500 g。不同处理的区域各取4份，共12份样品。在土样采集时均佩戴无菌手套，将采集的土壤样品迅速置于冰盒中存放，一部分样品用于土壤理化性质的分析，一部分用于土壤微生物DNA的提取 ，用于提取DNA的土壤样品带回实验室后立即进行DNA的提取。

1.2 土壤理化性质测定将采集到的土壤自然晾干，按标准法测定样品的基本理化性质[13]。测量指标为：pH值、有机质（Organic Matter，OM)、全氮（Nitrogen，N）、碱解氮（Alkali-hydrolyzable nitrogen，HN）、全 磷（Phosphorus，P）、速效磷（Olsen-P，OP）、全钾（Potassium，K）、速效钾（Avail K，AK）。

1.3 土壤微生物DNA提取及测序将采集到的土壤进行DNA的提取，采用德国QIAGEN公司的DNeasy PowerSoil Kit试剂盒，按说明书提取。通过超微量分光光度计（NanoDrop 1000）检测DNA浓度≥20 ng·mL-1，OD260/280为1.8～2.0。即为合格。提取的DNA保存于-40 ℃条件下用于后续PCR扩增。

扩增细菌16S rDNA基因的引物采用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，并采用IIIumina Miseq 2·300测序平台对PCR扩增产物进行双端测序 。测序部分由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.4 微生物多样性分析测序完成后，对有效序列进行去杂、修剪、去除嵌合体等过滤处理，得到优化序列。基于OTU聚类分析结果，对OTU进行多种多样性指数分析，以及对测序深度的检测；基于分类学信 息，在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对土壤理化性质的影响由表1可见，与对照（TLG3）相比，施加蚯蚓粪、蚯蚓粪和化肥处理后土壤理化性质表现出明显差异，所测指标都有明显上升，均具有显著性差异（P＜0.05）。两个处理组相比，除施加蚯蚓粪组（TLG1）的pH和速效钾高于蚯蚓粪加化肥处理组（TLG2）外，其他的理化因子指标都 相反，其中全氮、全磷、全钾、碱解氮和速效钾达到显著性差异。

表1 不同处理方式下槟榔种植区土壤的理化性质Tab. 1 Soil physical and chemical properties in the rhizosphere of arecanut plants in the arecanut plantation

2.2 不同处理方式下槟榔土壤细菌的多样性分析

2.2.1 不同处理对细菌群落多样性的影响97%相似水平上对土壤样品细菌群落进行alpha多样性指数分析，结果（表2）表明，与对照组相比，施加蚯蚓粪组和蚯蚓粪加化肥组槟榔土壤细菌的Shannon指数有明显升高，Simple指数明显降低，表明施加蚯蚓粪和蚯蚓粪加化肥处理后槟榔土壤细菌群落多样性升高，且只施加蚯蚓粪的处理组中的细菌群落多样性高于施加蚯蚓粪和化肥的处理组。

表2 细菌群落多样性指数Tab. 2 Diversity index of bacterial community in the rhizosphere

2.2.2 不同处理对土壤细菌类群分布的影响在属水平上对OTU进行聚类分析，得到不同处理组的槟榔树土壤的细菌群落结构组成，结果（图1）表明，在属水平上只施加蚯蚓粪的处理中，主要的菌属为热酸菌属（Acidothermus，9.45%）、norank_f_norank_o_Acidobacteriales（3.84%）、不动杆菌属（Acidibacter，3.69%）、Occallatibacter（3.04%）；在施加蚯蚓粪加化肥的处理组中，主要的属为热酸菌属（Acidothermus，13.84%）、norank_f_norank_o_Acidobacteriales（3.52%）、不动杆菌属（Acidibacter，5.18%）、norank_f_Xanthobacteraceae（4.88%）；在对照组中主要的属为：norank_f_norank_o_Subgroup_2（10.99%）、norank_f_norank_o_Acidobacteriales（9.48%）、独活假丝酵母属（Candidatus Solibacter，5.19%）。此外还包括norank_f_norank_o_Acidobacteriales、norank_f_norank_o_Subgroup_2、norank_f_Xanthobacteraceae、norank_f_norank_o_Elsterales、norank_f_norank_o_norank_c_norank_p_WPS-2、norank_f_norank_o_norank_c_AD3和Conexibacter等。

图1 属水平下槟榔土壤细菌群落结构组成Fig. 1 Bacterial community composition at the genus level in the rhizosphere of arecanut plants

2.2.3 不同处理下的细菌类群显著性差异分析分别对蚯蚓粪组和蚯蚓粪加化肥组与对照组的细菌类群在属的水平上进行了组间差异分析。结果（图2）表明，在只施加蚯蚓粪与对照的比较中（图2-a），norank_f_norank_o_Acidobacteriales、独活假丝酵母属（Candidatus Solibacter）、norank_f_norank_o_norank_c_AD3和Conexibacter达到了极显著水平，norank_f_norank_o_Subgroup_2达到了显著性水平。在施加蚯蚓粪-化肥的处理组与对照的比较中（图2-b），热酸菌属（Acidothermus）、独活假丝酵母属（Candidatus Solibacter）和Conexibacter达到了极显著水平，norank_f_norank_o_Subgroup_2、norank_f_norank_o_Acidobacteriales和norank_f_norank_o_norank_c_AD3达到了显著性水平。

图2 不同处理下细菌菌属与对照组差异分析a. 施加蚯蚓粪后；b. 施加蚯蚓粪和化肥后。*表示具有显著性差异；**和***表示具有极显著性差异。Fig. 2 Analysis of difference in bacteria at the genus level between the treatments and the controla. Bacterial difference between TLG1 and TLG3 at the genus level; b. Bacterial difference between TLG2 and TLG3 at the genus level. * indicates that there are significant differences between the two treatments；** and *** indicate that there are extremely significant differences in the figure.

2.2.4 不同处理下土壤理化性质与微生物分布的相关性分析结合理化性质，在细菌门水平上对施加蚯蚓粪前后的土壤和对照组进行了Redundancy Analysis（RDA）分析（图3）。RDA分析显示，第一主轴能够解释所有信息的72.21%，第二主轴能够解释11.30%，两者累计解释所有信息的83.51%。pH和速效钾对物种影响程度最大，各环境因子之间均呈正相关。只施加蚯蚓粪组中，TLG1-1、TLG1-3、TLG1-4微生物群落变化与所有环境因子之间呈正相关，TLG1-2与全钾、速效磷呈负相关，与其余环境因子呈正相关。蚯蚓粪加化肥组中，TLG2-1、TLG2-3、TLG2-4与所有环境因子呈正相关，TLG2-2与所有环境因子呈负相关。对照组中所有样本微生物群落变化与所有环境因子呈负相关。变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门（Actinobacteria）与所有环境因子呈正相关，WPS-2、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）与所有环境因子呈负相关。其微生物群落程度表现为：酸杆菌门（Acidobacteria）＞绿弯菌门（Chloroflexi）＞WPS-2。

图3 不同处理下微生物群落与土壤指标RDA排序图Fig. 3 RDA ordination diagram for microbial community and soil index of each treatment

2.2.5 不同处理下物种间的相关性为了分析物种与物种之间的相关性，在门的水平上对样本丰度前50的种进行单因素网络分析（图4）。对照组中分类水平总丰度前50的物种中（图4-c），主要的门为Acidobacteriota（17）、Firmicutes（3）、Planctomycetota（1）、Chloroflexi（9）、WPS-2（1）、GAL15（3）、Myxococcota（1）、Proteobacteria（10）、Actinobacteriota（6）、FCPU426（1）和Bacteroidota（1）；在只施加蚯蚓粪的处理组中（图4-a），主要的门为Cyanobacteria（1）、Actinobacteriota（14）、Proteobacteria（19）、WPS-2（2）、Patescibacteria（1）、Acidobacteriota（11）和Chloroflexi（2）；在施加蚯蚓粪和化肥的处理组中（图4-b），主要的门为Proteobacteria（20）、Actinobacteriota（11）、Acidobacteriota（11）、WPS-2（2）、Patescibacteria（1）和Chloroflexi（5）。可以看出前50丰度的物种在门水平上处理组相对于对照组少了Firmicutes、Planctomycetota、GAL15、Myxococcota、FCPU426和Bacteroidota所包含的菌种。只施加蚯蚓粪的处理组中多出了Cyanobacteria门的一种菌（s_unclassified_g_norank_f_norank_o_Chloroplast），丰度前50的物种有8种与其有相关性，其中大多数为负相关。施加蚯蚓粪-化肥的处理组中多出了Patescibacteria门的一种菌（s_uncultured_bacterium_g_norank_f_LWQ8），丰度前50的物种有8种与其有相关性，其中大多数为正相关。

图4 不同处理下单因素网络分析a. 施加蚯蚓粪组；b. 施加蚯蚓粪加化肥组；c. 对照组。图中节点的大小表示物种丰度大小，不同颜色表示不同的物种；连线的颜色表示正负相关性，红色表示正相关，绿色表示负相关；线的粗细表示相关性系数的大小，线越粗，表示物种之间的相关性越高；线越多，表示该物种与其他物种之间的联系越密切。Fig. 4 Monofactor network analysis of different treatments a. Monofactor network analysis of TLG1; b. Monofactor network analysis of TLG2; c. Monofactor network analysis of TLG3. The size of nodes in the graph indicates the species richness, and different colors indicate different species; the color of lines indicates positive and negative correlation, red indicates positive correlation, and green indicates negative correlation; the thickness of lines indicates the size of correlation coefficient; the thicker the line, the higher the correlation between the species;the more the lines, the closer the relationship between a species and other species.

3 讨 论

施加蚯蚓粪可以提高土壤pH，有效抑制土壤的酸化；且槟榔种植区的土壤有机质、全氮、全磷、全钾、碱解氮、速效磷和速效钾的含量均有明显增加。土壤有机质是土壤养分的重要组成部分[14]，能够改善土壤的物理和理化性质[15]，同时也是各种植物生长的营养来源[16]。施加蚯蚓粪后土壤中有机质含量有明显升高，表明其土壤得到了改善。

97%相似水平上对土壤样品细菌群落进行alpha多样性指数分析，结果表明，施加蚯蚓粪后其微生物多样性升高，这与周东兴等[17]的研究结果一致，周东兴等人通过研究施加蚯蚓粪对温室黑土酶活性以及细菌多样性的影响，证明蚯蚓粪的施加提高了土壤的细菌多样性。施加蚯蚓粪及蚯蚓粪-尿素的处理均对土壤微生物的多样性造成了显著的影响，如独活假丝酵母属（Candidatus Solibacter）和Conexibacter出现了显著性差异，其中独活假丝酵母属（Candidatus Solibacter）已有报道表明其为分解有机质、利用碳源的菌属，与土壤有机质含量呈正相关关系[18]。通过土壤理化性质和微生物在细菌门水平上分布的RDA分析，结果表明，理化因子之间速效钾的含量达到显著性差异，同时N、P、K的含量都有所增高。这与王英男等[19]研究蚯蚓粪可以提高土壤营养物质N、P、K含量是一致的。

通过单因素网络分析施加蚯蚓粪和施加蚯蚓粪和化肥后的土壤。只施加蚯蚓粪的处理组中多出了Cyanobacteria门的一种菌（s_unclassified_g_norank_f_norank_o_Chloroplast），施加蚯蚓粪-化肥的处理组中多出了Patescibacteria门的一种菌（s_uncultured_bacterium_g_norank_f_LWQ8）。这两种未命名的菌种对槟榔黄化也许有一定影响。

蚯蚓粪在促进作物生长、提高产量、改善土壤肥力和抑制植物病害等方面均有重要作用[20]。钱春桃等[21]将蚯蚓粪肥均匀撒施在松花菜地里，发现可以有效降低连作地土壤水溶性盐总量（EC），缓解土壤酸化，提高土壤速效碳氮钾的含量；张峰等人[22]发现蚯蚓粪肥极显著提高土壤NaOH-Po含量和酸性磷酸酶活性，有效促进NaOH-Po活化的同时提高微生物对磷的贮存能力，提高磷肥利用率。因此，研究表明蚯蚓粪对改善土壤肥力以及保证作物健康生长具有重要的作用。本研究通过高通量测序技术对外源施加蚯蚓粪对槟榔种植区的土壤微生物多样性进行了比较分析，结果表明，施加蚯蚓粪可显著提升土壤养分，改善土壤状况，增强微生物之间的多样性。此结果为深入解析蚯蚓粪对槟榔黄化的缓解机制奠定基础。