大黄对大鼠肠道菌群的影响

聂银利，段学清，陈 瑞，朱 晨，谢 鑫，田维毅

（1.贵州中医药大学2018级硕士研究生，贵州 贵阳 550025；2.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025）

人体消化道内存在约100万亿个微生物群，包括细菌、古菌、病毒和真核生物，而人体肠道内的细菌种类复杂多样，多达500～1000种，这些细菌称为肠道菌群，其中大肠杆菌属（Colibacillus）、拟杆菌属（Bacteriodes）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）和梭菌属（Clostridium）等为肠道的主要优势菌属［1-3］。近年来研究表明，肥胖、糖尿病和心血管等代谢紊乱性疾病与肠道菌群结构和功能的改变密切相关［4-6］。因此，以肠道菌群为靶点的药物干预可为疾病的预防及临床治疗提供新的思路。

中药给药主要以口服的方式，中药进入肠道后会对肠道菌群进行调节，同时肠道菌群也会对中药成分进行代谢转化［7］。中药大黄（Rheum palmatum L.）作为苦寒中药，具有攻积滞、清湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒、抗炎等功效［8］。然而，大黄对各肠段菌群的作用目前尚未有报道。本研究对普通大鼠分别灌予低、中、高剂量的大黄，在连续给药时间7、14和21天后分别检测各肠段大肠杆菌、乳酸菌、拟杆菌和梭菌等4大肠道主要优势菌的数量变化。研究结果可为临床合理使用苦寒中药积累数据。

1 材 料

动物。SPF级SD雄性大鼠90只，8周龄，体质量（200±20）g，购自重庆腾鑫生物技术有限公司（实验动物生产许可证号SCXK（军）2012-0011）。实验动物饲养于贵州医科大学实验动物中心（许可证号SYXK（黔）2018-0001），分笼常规饲养，自由进食饮水。动物相关操作经贵州医科大学动物伦理委员会批准（批准号NO1503018）。

药物与试剂。大黄（Rheum palmatum L.）药材购自北京同仁堂贵阳药店，经贵州中医药大学生药专家周涛教授形态学鉴定为蓼科植物唐古特大黄干燥的茎和根。常规制备大黄水煎液，将100g大黄浸泡于1 L无菌去离子水中，进行2次煎煮（每次30min），收集水煎液，用Millex-Gp滤器（北京博尔金科技有限公司，批号SLGP033RB）过滤除菌后4℃保存备用。研究所使用的抗生素为盐酸林可霉素注射液（河南天方药业有限公司，批号070120049）；细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、2×Taq PCR StarMix with Loading Dye和2×RealStar Green Fast Mixture with ROX（北京康润诚业生物科技有限公司，批号分别为B027008019、D201-04、A012-10和A303-05）。

肠道菌群。大肠杆菌（J01859）、拟杆菌（JQ186609）、乳酸菌（AP014680）和梭菌（BA000016）的16S rRNA基因序列来自GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）数据库，根据这些序列设计相应的特异引物，并在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.gov/BLAST/）上进行比对，分析引物的特异性。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以上4种肠道主要优势菌群来自正常和药物干预大鼠的十二指肠、空肠、回肠及结肠等肠段（含内容物）。

2 方 法

分组与给药。90只大鼠随机分为正常组、大黄低剂量组、大黄中剂量组、大黄高剂量组和抗生素组（每组18只）。中药给药剂量为高剂量7.5g/kg，中剂量1.5g/kg，低剂量0.3g/kg［9］；抗生素给药剂量为0.2g/kg［10］；正常组灌予等体积无菌去离子水。给药方式为灌胃且体积为每天2mL/只，连续灌胃21天。

取材。在药物干预7、14和21天后随机分别抽取各组大鼠6只断椎处死，大鼠处死前需12 h禁食。收集大鼠十二指肠、空肠、回肠和结肠等各段肠管（含内容物）于无菌试管内，-80 ℃保存备用，整个取材过程均为无菌操作。

菌群分析。提取上述所取样品的基因组DNA（试剂盒法）。用大肠杆菌、拟杆菌、乳酸菌、及梭菌等4种肠道优势菌的16S rRNA基因特异性引物和各肠段样本DNA（正常组）模板进行PCR反应，分别构建含各优势菌特异片段的克隆载体，并获得相应的质粒。以这些质粒为标准品，用NanoDrop Lite型核酸蛋白检测仪（美国Thermo公司）检测其吸光度（A260值），参照刘茜明等［11］换算1μL各标准品基因组DNA的拷贝数，并将各标准品DNA以10倍梯度稀释至1μL样品中目的DNA的拷贝数为1×107～1×102。以这些稀释后的目的DNA为模板进行qRT-PCR反应。以标准品DNA拷贝数的对数为横坐标，以反应过程中达到荧光阈值的初始循环数（Ct）为纵坐标，分别绘制上述4种肠道主要优势菌的qRT-PCR标准曲线。将正常组、大黄低剂量组、大黄中剂量组、大黄高剂量组和抗生素组的各肠段样本基因组DNA稀释10倍作为模板进行qRTPCR反应，获得相应的Ct值，通过标准曲线换算出各样本基因组DNA拷贝数的对数值［12］。上述qRT-PCR反应中，每个实验均做3个样本重复和3次生物学重复。

PCR和qRT-PCR反应的引物为大肠杆菌，5'-AATGGCGCATACAAAGAGAAGC-3'，5'-GTTGCAGACTCCAATCCGGA-3'，扩增片段长度为119 bp；拟杆菌，5'-TGGGTTTAAAGGGAGCGTAG-3'，5'-TGCGTACTCAAGGAAACCAG-3'，扩增片段长度为138bp；乳酸菌，5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAGGA-3'，5'-GGAACTTGGAGACAGGTGGT-3'，扩增片段长度为111bp；梭菌，5'-AATGGCGCATACAAAGAGAAGC-3'，5'-AACGGCGGTCTCATTAGAGT-3'，扩增片段长度为117 bp。PCR反应2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 10μL，10μmoL/L的正、反向引物各1μL，模板DNA 0.5μL，补水至20μL。程序为94℃ 5min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，35个循环，72℃5min。反应于TC-96型梯度PCR仪（杭州博日科技有限公司）上进行。qRT-PCR：2×RealStar Green Fast Mixture with ROX 10μL，10μmoL/L-1的正、反向引物各0.5μL，模板DNA 1μL，补水至20μL，程序为：95℃ 2min，95℃ 10s，60℃ 30s，40个循环。反应于CFX96 TOUCH型实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪（美国Bio-Rad公司）上进行。

3 结 果

细菌的标准曲线。以对照品DNA为模板进行qRTPCR，绘制大肠杆菌、拟杆菌、乳酸菌及梭菌的标准曲线，各菌模板浓度的对数与Ct之间呈较好的线性关系。

大肠杆菌。相较于正常组。①在十二指肠：大黄低、中、高剂量组和抗生素组大肠杆菌数量在连续给药7天和21天后都显著降低；在连续给药14天后，大黄低剂量组和抗生素组大肠杆菌数量显著降低，而大黄中、高剂量组大肠杆菌数量无明显变化（图1A）。②在空肠：大黄低剂量组大肠杆菌数量在连续给药7天后显著降低，在连续给药14天后出现显著升高，而在连续给药21天后无明显变化；大黄中、高剂量组大肠杆菌数量在连续给药7天后都显著降低，而在连续给药14天和21天后都显著升高；抗生素组大肠杆菌数量在连续给药7天后无明显变化，而在连续给药14天和21天后都显著升高（图1B）。③在回肠：大黄低剂量组大肠杆菌数量在连续给药7、14和21天后显著升高；大黄中剂量组和抗生素组大肠杆菌数量在连续给药7天后无明显变化，在连续给药14天和21天后显著升高；大黄高剂量组大肠杆菌数量在连续给药7和14天后无明显变化，在连续给药21天后出现显著升高（图1C）。④在结肠：大黄低、中、高剂量组大肠杆菌数量在连续给药7天后都显著升高，在连续给药14天后，大黄低剂量组大肠杆菌数量出现显著降低，而大黄中、高剂量组大肠杆菌数量都无明显变化，在连续给药21天后，大黄低剂量组大肠杆菌数量继续显著降低，而大黄中、高剂量组大肠杆菌数量都出现显著降低；大黄抗生素组大肠杆菌数量在连续给药7、14和21天后都显著降低（图1D）。以上结果提示：①本研究所使用的抗生素剂量能促进空肠和回肠大肠杆菌的生长，抑制十二指肠和结肠大肠杆菌的生长；②大黄对十二指肠大肠杆菌的生长具有抑制效应，对回肠大肠杆菌的生长具有促进效应，对空肠大肠杆菌生长的影响是先抑制后促进，而对结肠大肠杆菌生长的影响是先促进后抑制。以上促进或抑制效应有着明显的量-时规律。

图1中A-D分别为连续给药7、14和21天后大鼠十二指肠、空肠、回肠及结肠大肠杆菌数量的变化。

图1 大黄对大鼠各肠段大肠杆菌数量的影响 （±s，n=6）

拟杆菌。相较于正常组。①在十二指肠，大黄低、中、高剂量组和抗生素组拟杆菌数量在连续给药7天后都显著升高，连续给药14天后都显著降低，连续给药21天后都无明显变化，且大黄高剂量组较大黄低、中剂量组变化大（图2A）。②在空肠：大黄低、中、高剂量组拟杆菌数量在连续给药7天和14天后都无明显变化，在连续给药21天后均显著升高，且大黄低剂量组较大黄中、高剂量组变化大；抗生素组拟杆菌数量在连续给药7天后显著升高，在连续给药14天后显著降低，在连续给药21天后无明显变化（图2B）。③在回肠：大黄低、中、高剂量组拟杆菌数量在连续给药7和21天后都显著升高，在连续给药14天后都无明显变化；抗生素组拟杆菌数量在连续给药7和14天后无明显变化，在连续给药21天后显著升高（图2C）。④在结肠：大黄低、中、高剂量组拟杆菌数量在连续给药7、14和21天后均显著升高；抗生素组拟杆菌数量在连续给药7天和14天后无明显变化，在连续给药21天后显著降低（图2D）。以上结果提示：①研究所使用的抗生素剂量能促进回肠拟杆菌的生长，抑制结肠拟杆菌的生长，对十二指肠和空肠拟杆菌生长的影响是先促进后抑制；②大黄对空肠、回肠和结肠拟杆菌的生长具有促进效应，而对十二指肠拟杆菌生长的影响是先促进后抑制。以上促进或抑制效应有着明显的量-时规律。

图2中A-D分别为连续给药7、14和21天后大鼠十二指肠、空肠、回肠及结肠拟杆菌数量的变化。

图2 大黄对大鼠各肠段拟杆菌数量的影响 （±s，n=6）

乳酸菌。相较于正常组。①在十二指肠：大黄低、中、高剂量组和抗生素组乳酸菌数量在连续给药7天和14天后都无明显变化；在连续给药21天后，大黄低、中、高剂量组乳酸菌数量都显著升高，抗生素组乳酸菌数量显著降低（图3A）。②在空肠：大黄中、高剂量组乳酸菌数量在连续给药7天和14天后均显著降低，在连续给药21天后均显著升高；大黄低剂量组乳酸菌数量在连续给药7天后显著降低；在连续给药14天后无明显变化，在连续给药21天后均显著升高；抗生素组乳酸菌数量在连续给药7天后无明显变化，在连续给药14天后显著降低，在连续给药21天后显著升高（图3B）。③在回肠：大黄低、中、高剂量组乳酸菌数量在连续给药7天后都显著升高，在连续给药14天和21天后均显著降低；抗生素组乳酸菌数量在连续给药7天和21天后显著升高，在连续给药14天后显著降低（图3C）。④在结肠：大黄低、中、高剂量组乳酸菌数量在连续给药7天后均显著升高，在连续给药14天和21天后均显著降低；抗生素组乳酸菌数量在连续给药7、14和21天后无明显变化（图3D）。以上结果提示：①本研究所使用的抗生素剂量能促进回肠乳酸菌的生长，抑制十二指肠乳酸菌的生长，对空肠乳酸菌生长的影响是先抑制后促进，对结肠乳酸菌的生长无影响；②大黄对十二指肠乳酸菌的生长具有促进效应，对空肠乳酸菌生长的影响是先抑制后促进，对回肠和结肠乳酸菌生长的影响是先促进后抑制。以上促进或抑制效应有着明显的量-时规律。

图3中A-D分别为连续给药7、14和21天后大鼠十二指肠、空肠、回肠及结肠乳酸菌数量的变化。

图3 大黄对大鼠各肠段乳酸菌数量的影响 （±s，n=6）

梭菌。相较于正常组。①在十二指肠：大黄低、中剂量组梭菌数量在连续给药7、14和21天后都显著降低；大黄高剂量组梭菌数量在连续给药7天后显著降低，在连续给药14天和21天后无明显变化；抗生素组梭菌数量在连续给药7天和14天后显著降低，在连续给药21天后无明显变化（图4A）。②在空肠：大黄中、高剂量组梭菌数量在连续给药7、14和21天后均显著降低；大黄低剂量组梭菌数量在连续给药7天和21天后显著降低，在连续给药14天后无明显变化；抗生素组梭菌的数量在连续给药7天和14天后出现显著降低，在连续给药21天后无明显变化（图4B）。③在回肠：大黄低、中、高剂量组梭菌数量在连续给药7和21天后均显著降低，在连续给药14天后无明显变化；抗生素组梭菌数量在连续给药7天和21天后无明显变化，在连续给药14天后显著降低（图4C）。④在结肠：大黄低剂量组梭菌数量在连续给药7和21天后显著降低，在连续给药14天后无明显变化；大黄中剂量组梭菌数量在连续给药7天后显著降低，在连续给药14天和21天后无明显变化；大黄高剂量组梭菌数量在连续给药7天和14天后显著降低，在连续给药21天后无明显变化；抗生素组梭菌数量在连续给药7天后明显升高，在连续给药14天后无明显变化，在连续给药21天后显著降低（图4D）。以上结果提示：①本研究所使用的抗生素剂量能抑制十二指肠、空肠和回肠梭菌的生长，对结肠梭菌生长的影响是先促进后抑制；②大黄对十二指肠、空肠、回肠和结肠梭菌的生长具有抑制效应。以上促进或抑制效应有着明显的量-时规律。

图4中A-D分别为连续给药7、14和21天后大鼠十二指肠、空肠、回肠及结肠梭菌数量的变化。

图4 大黄对大鼠各肠段梭菌数量的影响 （±s，n=6）

大黄对肠道大肠杆菌、拟杆菌、乳酸菌和梭菌等4大优势菌数量的影响在各肠段有一定的差异，且存在量-时规律。

4 讨 论

近年来，临床和实验研究表明，中西医结合治疗可显著提高疾病的疗效［13］。大黄是蓼科植物的一种，在中国作为草药使用多年。研究发现，大黄及其活性成分大黄素通过降低炎症因子的表达水平而具有强大的抗炎活性，从而降低炎症对身体损害，并可治疗急性胰腺炎［14］。Karakan等［15］报道了急性胰腺炎与肠道菌群失调有关。另外，《神农本草经》记载大黄粉有通便、泻药作用［16］。Lin等［17］也报道了大黄具有通便和泻药的作用，提示大黄能缩短肠功能恢复的时间，缓解腹胀和腹痛。由此可见，了解大黄对各肠段肠道菌群的影响是非常必要的。

然而，在肠道中，由于各肠段的生理状态不同及个体差异使得肠道菌群在肠道内的分布存在差异［18-20］。大量的研究显示，十二指肠主要分布着大肠菌和厌氧菌；空肠主要分布着链球菌、葡萄球菌和乳酸杆菌等需氧菌；回肠主要分布着厌氧菌和需氧菌，且厌氧菌多于需氧菌；结肠主要分布着专性厌氧菌，且可能由于结肠蠕动缓慢，弱碱性或中性的环境导致结肠中细菌的含量远远多于十二指肠、空肠和回肠中的细菌含量［21-23］。

大黄对大肠杆菌的影响。大肠杆菌为革兰氏阴性杆菌，也是目前临床肠道感染常见的条件致病菌，具有多重耐药的特性［24］。许多研究显示，大肠杆菌与炎症性肠病和肠道癌症密切相关［25-27］。研究中，在十二指肠：低、中、高剂量的大黄连续给药7天和21天都对大肠杆菌的生长具有抑制作用；然而，在连续给药14天后，中、高剂量大黄对大肠杆菌生长的抑制作用丧失。这一现象可能是由于连续给药使得肠道菌群紊乱所致。在空肠：低、中、高剂量大黄连续给药7天对大肠杆菌的生长具有抑制作用，而在连续给药14天后这种抑制作用变为促进作用。这一现象可能是由连续给药干扰了肠道内其他菌群的生长，而对大肠杆菌的生物拮抗能力减弱导致。在回肠：低、中、高剂量大黄对大肠杆菌的生长具有促进作用，只是中、高剂量大黄对大肠杆菌生长的促进作用来得较晚。这一现象可能是中药的双向调节作用引起。在中药的干预中，由于其成分复杂多样及各成分的含量差异常常使得中药表现多种效果，且就某一成分而言，其药效在一定范围内随着剂量的升高而增加，也有可能两方面的药效中和，表现平衡状态［28］。因此，高剂量和低剂量中药常常表现药效相反的现象。如靳珠华等［29］研究发现，大黄多糖能促进小鼠脾淋巴细胞内钙内流，但随着大黄多糖剂量的增加，这种促进作用转变为抑制作用。在结肠：低、中、高剂量大黄对大肠杆菌的生长先表现促进作用后表现抑制作用。中医认为大黄具有通便、泻药作用。这一现象可能是由于大黄通过排泄将大肠杆菌排出所致。总之，除了回肠，大黄对十二指肠、空肠和结肠大肠杆菌的生长在一定的给药时间内都具有抑制作用。以上结果提示大黄可通过抑制大肠杆菌的生长有效预防和改善炎症性肠病和肠道癌症。见图1。

大黄对拟杆菌的影响。拟杆菌属是肠道厌氧性革兰氏阴性杆菌，其具有分解多糖和调节肠道微生态的功能［30-31］。Larsen等［32］和Ley等［33］报道了拟杆菌属与糖尿病、肥胖等代谢性疾病的发生发展密切相关。本研究中，在十二指肠：低、中、高剂量大黄对拟杆菌的生长先表现促进作用后表现抑制作用，且高剂量较低、中剂量的作用更明显。这一现象可能是由于连续给药干扰了肠道内其他菌群的生长，而对拟杆菌生长的促进作用减弱导致。在空肠、回肠和结肠：大黄对空肠、回肠和结肠拟杆菌的生长都具有促进作用的趋势。且在空肠，大黄的这种促进作用来得较迟。在回肠，大黄的这种促进作用在连续给药14天后并不显现。这一现象可能是由于连续给药使得肠道菌群紊乱和中药的双向调节作用所导致。大黄对十二指肠、空肠、回肠和结肠拟杆菌的生长在一定的给药时间内都有促进作用的趋势。以上结果提示大黄可促进拟杆菌的生长，这为大黄治疗糖尿病、肥胖等代谢性疾病提供数据。见图2。

大黄对乳酸菌的影响。乳酸菌为肠道内常见的革兰氏阳性菌，是益生菌。它可调节肠道微生态的平衡来维持机体的健康。另外，乳酸菌还具有抗肿瘤，降低胆固醇和治疗便秘和腹泻等功能［34-36］。另外，有研究显示乳酸菌能修复肠道的菌群失调从而有助于治疗脓毒症［37］。本研究中，在十二指肠：低、中、高剂量大黄能促进乳酸菌的生长，这种促进作用在连续给药21天后才显著。在空肠：低、中、高剂量大黄对乳酸菌的生长先表现抑制作用后表现促进作用。这一现象可能是由于连续给药干扰了肠道内其他菌群的生长，而对乳酸菌的生物拮抗能力减弱导致。在回肠：低、中、高剂量大黄对乳酸菌的生长先表现促进作用后表现抑制作用。这一现象可能是由于连续给药使得肠道菌群紊乱所致。在回肠：低、中、高剂量大黄对拟杆菌的生长先表现促进作用后表现抑制作用。中医认为大黄具有通便、泻药作用。这一现象可能是由于大黄通过排泄将乳酸菌排出所致。总之，大黄对十二指肠、空肠、回肠和结肠乳酸菌的生长在一定的给药时间内都有促进作用的趋势。以上结果提示大黄可通过增加乳酸菌的数量来调节肠道菌群的生态平衡来预防和治疗脓毒症、肿瘤和便秘等疾病。见图3。

大黄对梭菌的影响。梭菌属为专性厌氧的革兰氏阳性菌，其可分泌外毒素。有研究显示，梭菌与肠道癌症的发生发展密切相关［38-39］。另外，Vrieze等［40］研究发现，肠道梭菌数量增加使得脂蛋白酶在肠道中的活性增强，从而导致脂肪的堆积引起肥胖。本研究中，大黄能抑制十二指肠、空肠、回肠和结肠梭菌的生长。然而，在十二指肠，高剂量大黄的这种抑制作用在连续给药14天和21天后丧失；在空肠，低剂量大黄的这种抑制作用在连续给药14天后丧失；在回肠，低、中、高剂量大黄的这种抑制作用在连续给药14天后丧失；在结肠，低剂量这种抑制作用在连续给药14天后丧失，中剂量这种抑制作用在连续给药14和21天后丧失，高剂量这种抑制作用在连续给药21天后丧失。出现这一现象可能是由于连续给药使得肠道菌群紊乱和中药的双向调节作用所导致。总之，大黄对十二指肠、空肠、回肠和结肠梭菌的生长具有抑制效应。以上结果提示大黄可通过抑制梭菌的生长来预防和改善肠道癌症和肥胖。见图4。

另外，抗生素的广泛应用导致大量耐药菌的产生，这已经困扰了医学界许多年。因此，抗生素的合理使用备受人们的广泛关注。在本研究中，林可霉素的使用也导致肠道菌群的微生态紊乱，这一现象与罗海燕等［41］研究发现的现象相类似。见图1-4。

综上所述，大黄对肠道菌群的影响在各肠段存在一定的差异，且具有明显的量-时规律。