高效液相色谱法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量方法的比较研究

司舒杰，魏颖轩

（1 内蒙古第四医院，内蒙古 呼和浩特；2 内蒙古包头市食品药品检验检测中心，内蒙古 包头）

0 引言

《中国药典》2015 版一部载有黄芪药材及饮片，其在临床应用广泛，同时也作为保健食品深受市场欢迎。因此，黄芪的质量控制显得尤为重要。在本次对毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定时发现，按照乙腈-0.2%甲酸（20：80）为流动相，检测波长260nm，检测时间可以缩短至30min甚至更短，并且避免了药典方法中由于梯度洗脱造成的明显杂峰和基线不稳定的情况，根据以上发现，对36 批样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定，并与药典方法的含量结果进行对比。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20A 高效液相色谱仪（紫外检测器）。Thermo Ultiamate3000 高效液相色谱仪。万分之一天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司,AL204-IC]。十万分之一天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司,BP-211D]。

1.2 试药

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品批号：111920-201606，纯度：97.6%（来源：中国食品药品检定研究院）；样品以黄芪饮片为主，共34 批次（占94.44%）；黄芪药材2 批次（占5.56%）。标示生产企业27 家，覆盖9 个省市自治区，其中河北省10 家，内蒙古自治区6 家，安徽省3 家，北京市和甘肃省各2 家，陕西省、四川省、广东省和黑龙江省各1 家；乙腈、甲醇为色谱纯，甲酸为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

药典方法：色谱柱为Welch Ultimate XB-C18（5μm，4.6mm×250mm）；以乙腈为流动相A，以0.2%甲酸溶液为流动相B，按表1 中的规定进行梯度洗脱；流速 1.0ml/min；检测波长 260nm；柱温 30℃；进样量10μl。见表1。

表1 洗脱条件

新方法：色谱柱为Welch Ultimate XB-C18（5μm，4.6mm×250mm）；流动相为乙腈-0.2% 甲酸溶液（20：80），流速1.0ml/min；检测波长260nm；柱温30℃；进样量10μl。

2.2 溶液制备

对照品溶液的制备：称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品13.34mg，精密称定，置25ml 量瓶中，加甲醇至刻度摇匀，再取1ml，置10ml 量瓶中，加甲醇至刻度摇匀，制成每1ml含52.08μg 的对照品溶液。

供试品溶液的制备：两种方法均按《中国药典》2015年版一部黄芪项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定的方法制备供试品溶液[1]。

2.3 两种方法测定结果比较

2.3.1 图谱的比较

分析图谱结果得出药典方法进行梯度洗脱时，在35min 之后有明显的杂峰和基线不平稳的现象，在基线、空白、标准品和对照品的谱图中均出现，说明并非样品的杂峰，而是梯度洗脱造成的影响，而在改进条件下可见，基线平稳，且可将采集时间减少至30min 甚至更短；并且在样品色谱图中可见主峰附近杂峰也较多，杂峰与主峰间分离度有时达不到要求，而在改进条件下可见基线较平稳，主峰周围杂峰也较少。

2.3.2 含量测定结果的比较

两种方法的含量测定结果对比发现，8 组数据药典方法的含量高于新方法的含量，占总样品量的22.2%，28组数据新方法的含量高于药典方法含量，占总样品量的77.8%。结果见表2。

表2 两种方法测得的样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量

3 新方法的方法学考察

3.1 纯度试验

将毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品及供试品溶液在DAD检测器下做全波长扫描，测得样品峰与对照品峰的吸收光谱形状一致，峰纯度符合要求，说明其为同一物质。

3.2 稳定性试验

取同一份供试品溶液，室温下分别于放置0h、2h、4h、8h、12h、24h 进行测定，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷在24h之内峰面积积分值基本稳定不变。RSD 为0.2%（n=6），表明室温下供试品溶液放置24h 内稳定。

3.3 精密度试验

取同一供试品溶液10μl，按新方法色谱条件连续进样6 次，测定峰面积。结果RSD 为0.6%（n=6），表明仪器精密度良好。

3.4 线性关系考察

精密吸取配制好的对照品溶液2μl、4μl、8μl、10μl、16μl、20μl 分别进样。以峰面积A 为纵坐标、以毛蕊异黄酮葡萄糖苷进样量X(μg)为横坐标，绘制标准曲线。毛蕊异黄酮葡萄糖苷进样量在0.10416-1.0416μg范围内线性关系良好。回归方程为Y=2903675X+63116，R2=1。

3.5 加样回收试验

精密称定6 份已知含量的黄芪药粉约1g，置圆底烧瓶中，精密加入500μg 的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，精密加入甲醇50ml，按照供试品溶液制备方法操作，并测定含量，计算回收率。平均回收率为97.0%，RSD0.7%。

4 讨论

在对黄芪药材及饮片的含量测定时，其项下的毛蕊异黄酮葡萄糖苷的测定过程中发现主峰与周围杂峰分离效果差，达不到药典要求的分离度，在查阅了大量有关毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定的文献方法[2-8]后，通过总结发现文献多采用梯度洗脱的方法进行试验，经过验证梯度洗脱方法对于黄芪中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷分离效果欠佳，并且杂峰较多，基线不稳。因此，本试验尝试优化HPLC色谱条件并建立HPLC 测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法。

本试验以药典中“黄芪”项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷的色谱条件为基础，优化HPLC 色谱条件。检测时间可以缩短至30min，并且避免了药典方法中由于梯度洗脱造成的明显杂峰和基线不稳定的情况，根据以上发现，对36 批样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定，并与药典方法的含量结果进行对比。新方法所测的结果普遍比药典方法高，并且36 批样品的平均值也高于药典方法。

因此，笔者对建立的方法，以精密度、重复性、回收率等为考察指标，进行了方法学的考察，发现该含量测定方法可靠、重现性好，且具有一定的适用性。