胶原蛋白肽饮品对斑马鱼胶原蛋白基因表达影响

袁 媛，王彩霞，熊菲菲，雷 蕾，吴小艳，贾福怀

（宁波御坊堂生物科技有限公司，浙江宁波 315012）

胶原蛋白是一种广泛分布在各类动物的皮肤、骨骼中的蛋白质，一般呈纤维状，分子量较大，主要分布在细胞外基质中[1-2]。Ⅰ型胶原蛋白是组织中分布较广泛的胶原蛋白，主要存在于脊椎动物的结缔组织中[3]。斑马鱼肌肉和皮肤中胶原蛋白的主要成分是Ⅰ型胶原蛋白，鱼类的蛋白肽链包含2个α1和一个α2链，分别由COL1A1A，COL1A1B和COL1A2所编码[4]。胶原蛋白肽是胶原蛋白经过酶解使其分子链解体、断裂得到的一种产品，由2个或2个以上的氨基酸组成的蛋白质结构片段，其分子量为300 Da左右，分子量较小，易于吸收[5]。研究表明，胶原蛋白肽具有抗氧化性、美白护肤、保护肝脏等多种功效[6-8]。通过探究胶原蛋白肽饮品对斑马鱼胶原蛋白基因表达的影响，为生物体内胶原蛋白的生成促进关系提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验所使用的动物为野生型AB系斑马鱼，年龄为受精后5 d（5 dp）f。

养鱼水质：28℃下将200 mg速溶海盐加入1 L反渗透水，电导率为480~510μS/cm，pH值为6.9~7.2，硬度为53.7~71.6 mg/L CaCO3。

1.2 材料与试剂

胶原蛋白肽饮品（由胶原蛋白肽、果汁等组成），自制；1725121，iTaq Universal SYBR Green Supermix，Bio-rad公司提供；pr1701，2×Taq Master Mix，北京百泰克公司提供；1382739，TRI reagent，Invitrogen公司提供；T130144氯仿、E111963无水乙醇，阿拉丁公司提供；FastQuant RT Kit（With gDN-ase） 试剂盒（KR106天根）；A507048异丙醇，上海生工公司提供。

1.3 试验方法

1.3.1 胶原蛋白肽饮品最大检测质量浓度（MTC）测定

随机选取180尾5 dpf（受精后5 d） 野生型AB品系斑马鱼，放置在六孔板（容量3 mL），每孔中30尾斑马鱼。给予胶原蛋白肽饮品不同质量浓度，分别为6.25，12.50，25.00，50.00，100.00μL/mL，同时设置正常对照组。试验24 h后，观察记录斑马鱼的表型和死亡情况，确定胶原蛋白肽饮品对正常斑马鱼的MTC。

1.3.2 评价胶原蛋白肽饮品对胶原蛋白基因表达的影响

根据质量浓度摸索试验，胶原蛋白肽饮品对斑马鱼的MTC，设置3个剂量的试验质量浓度。随机选取120尾5 dpf（受精后5 d） 野生型AB系斑马鱼，放置在六孔板中，每个试验孔中30尾斑马鱼，分别给予不同剂量胶原蛋白肽饮品3 mL，剂量分别2.8，8.3，25.0μL/mL，同时设置正常对照组。各组经胶原蛋白肽饮品处理1 d后，使用Trizol法提取各试验组斑马鱼总RNA，然后对总RNA质量浓度和纯度进行测定。

1.4 数据处理与结果评定

取斑马鱼样品的总RNA，精确称量2μg，合成20μL cDNA置于-20℃下保存。基因表达的内参为β-actin，将3种Ⅰ型胶原基因COLLA1A，COL1A1B和COL1A2的RNA相对表达量。通过下面公式进行计算：

用方差分析和Dunnett's T-检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 胶原蛋白肽饮品最大检测质量浓度（MTC）测定

胶原蛋白肽饮品处理后“质量浓度-致死性”结果见表1。

表1 胶原蛋白肽饮品处理后“质量浓度-致死性”结果 （n=30）

胶原蛋白肽饮品在6.25，12.50，25.00μL/mL质量浓度时，未引起斑马鱼死亡，也没有产生明显的毒副作用。在50和100μL/mL质量浓度时，分别诱发47%（14/30尾） 和100%（30/30尾） 斑马鱼死亡。故确定胶原蛋白肽饮品对正常斑马鱼的MTC为25μL/mL。

2.2 RNA提取结果及引物序列信息

胶原蛋白肽饮品处理斑马鱼结束后，提取总RNA，测定RNA的质量浓度和A260/A280比值，A260/A280比值的结果均为1.80~2.20，表明提取的斑马鱼总RNA质量符合要求，q-PCR试验可以进行。

总RNA的质量浓度见表2，引物序列信息见表3。

表2 总RNA的质量浓度/μL·mL-1

表3 引物序列信息

2.3 胶原蛋白肽饮品对斑马鱼COL1A1A，COL1A1B和COL1A2基因表达的影响

根据基因相对表达量公式计算，胶原蛋白肽饮品不同质量浓度组分别为2.8，8.3和25.0μL/mL，其COL1A1A相对表达量分别为1.08，1.38和0.95，与正常对照组相比较，2.8和25.0μL/mL质量浓度组均p>0.05，8.3μL/mL质量浓度组p<0.05，提示胶原蛋白肽饮品在8.3μL/mL浓度条件下能促进COL1A1A基因的表达，在2.8和25.0μL/mL质量浓度条件下，对COL1A1A基因的表达均无明显作用。

胶原蛋白肽饮品不同质量浓度组2.8，8.3，25.0μL/mL，其COL1A1B相对表达量分别为0.85，1.48，0.78，与正常对照组相比较，2.8和25.0μL/mL质量浓度组均p>0.05，8.3μL/mL质量浓度组p<0.01，提示胶原蛋白肽饮品在8.3μL/mL质量浓度条件下能促进COL1A1B基因的表达，在2.8和25μL/mL质量浓度条件下，对COL1A1B基因表达无明显作用。

胶原蛋白肽饮品不同质量浓度组2.8，8.3，25μL/mL，其COL1A2相对表达量分别为0.99，1.44，1.03，与正常对照组相较，2.8和25μL/mL质量浓度组均p>0.05，8.3μL/mL质量浓度组p<0.05，提示胶原蛋白肽饮品在8.3μL/mL质量浓度条件下能促进COL1A2基因的表达，在2.8和25μL/mL质量浓度条件下，对COL1A2基因的表达无明显作用。

胶原蛋白肽饮品对斑马鱼COL1A1A，COL1A1B和COL1A2基因表达影响见表4。

表4 胶原蛋白肽饮品对斑马鱼COLA1A，COL1A1B和COL1A2基因表达影响

3 结论

斑马鱼（Danio rerio）是生长在印度淡水中的热带鱼，也存在于巴基斯坦淡水河流中，繁殖周期短、产卵量大、养殖方便。在基因同源性方面，斑马鱼与人类有80%以上，因此斑马鱼可用于人类机体功能的研究[9-11]。试验通过斑马鱼模型最大检测质量浓度（MTC） 试验后，设置低、中、高3个剂量组，分别为2.8，8.3，25.0μL/mL，研究结果表明胶原蛋白肽饮品在8.3μL/mL质量浓度条件下能明显促进胶原蛋白编码基因COL1A1A，COL1A1B，COL1A2的表达。

COL1A1A，COL1A1B，COL1A2为编码I型胶原蛋白的基因，用来分析胶原蛋白合成的重要方法[12-13]。胶原蛋白也是皮肤的主要成分，宋晓婧等人[14]研究发现，慢性光损伤者的COL1A1A，COL1A1B，COL1A2表达明显低于未照射组。研究结果表明，胶原蛋白肽饮品能促进胶原蛋白基因的表达，为胶原蛋白肽类产品的研究提供依据。