麝鼠生殖腺中凋亡体3个基因的表达分析

李天峰，叶筱彤，雷 行，满 欣，白素英，2*

（1.东北林业大学 野生动物与自然保护地学院，哈尔滨 150040；2.国家林业和草原局 野生动植物检测中心，哈尔滨 150040）

雄性哺乳动物的生殖腺包括睾丸和副腺（精囊腺和前列腺）。麝鼠（OndatrazibethicusLinnaeus）是一种小型毛皮动物。雄性麝鼠的生殖腺隐于体内，在腹腔下部。麝鼠的生殖腺会随着麝鼠繁殖的进行逐渐发育，在繁殖期后半程会逐渐萎缩，繁殖期结束后萎缩到最小。麝鼠睾丸在3月起开始逐渐发育，5月体积达到最大，8月开始逐渐萎缩，9月左右睾丸体积达到最小，约为最大体积的三分之一［1］。鲜义坤等［2］的研究证明了光周期与环境温度是调控麝鼠睾丸发育的重要环境因素，而麝鼠生殖腺周期变化由哪些基因调控目前还未见报道。

生物机体内环境的平衡与稳定，不仅仅依赖于细胞的增殖与分化，也依赖于细胞的凋亡。凋亡并不仅仅是细胞形态学的变化，而且与生物体内环境平衡、组织与器官发育、某些疾病的发生乃至细胞坏死等过程都有着密切的关系［3］。在细胞凋亡的整个过程中，有非常多的因素在其中扮演重要角色。细胞凋亡是一个由多条通路、多个基因共同调控的细胞程序性死亡过程，细胞受到刺激，响应凋亡信号，Cytc、SMAC与AIF等促凋亡因子释放到胞浆中，引发一系列精密的级联反应，促使细胞凋亡。细胞凋亡最终由Caspase家族基因执行。Caspase家族蛋白酶以不活跃酶原存在，在受到凋亡刺激后执行凋亡功能。Caspase蛋白酶分启动型与效应型，启动型负责接受凋亡信号并激活效应型Caspase蛋白酶，效应型Caspase蛋白酶通过不同途径促使细胞凋亡。

线粒体是一个含有双层膜的细胞器，同时线粒体的外膜间隙中也含有各种促凋亡因子，如Cytc、AIF和SMAC等。因此，线粒体外膜的完整性对细胞凋亡具有非常重要的意义。在细胞响应凋亡信号时，各种促凋亡因子从线粒体的膜间隙释放到细胞的胞浆中，从而引发一系列的级联反应，促使细胞凋亡。Cytc释放到胞浆后可以与Caspase-9蛋白、Apaf-1蛋白结合形成凋亡体，凋亡体是细胞凋亡时形成的重要结构。本试验通过分析结合成为凋亡体三个基因的表达，为深入了解麝鼠生殖腺发育的规律以及这些基因在麝鼠生殖腺发育周期中起到的调控作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

2019年5月初，由黑龙江省哈尔滨市某麝鼠养殖场订购6只体况相近的11月龄雄性麝鼠，每次采样前适应性饲养2 d，分别在5月4日和9月1日随机取3只麝鼠采用心脏注射法处死。取其腹腔下部的睾丸、前列腺和精囊腺，于液氮中速冻后放入冻存管中，准备提取前列腺、精囊腺和睾丸的RNA。将采集的睾丸样品记为ozt1、ozt2、ozt3、ozt4、ozt5和ozt6，将采集的前列腺样品记为ozp1、ozp2、ozp3、ozp4、ozp5和ozp6，将采集的精囊样品记为ozs1、ozs2、ozs3、ozs4、ozs5和ozs6，其中oz代表麝鼠，t代表睾丸，p代表前列腺，s代表精囊。

1.2 主要试剂、仪器与药品

试验所用主要试剂见表1，主要仪器见表2。

表1 主要试剂及来源

表2 主要仪器

1.3 RNA的提取与反转录

将试验所需要的睾丸、精囊与前列腺组织放入研钵中，加入液氮快速研磨；研磨充分后加入适量的TRIZol试剂，离心，取上清液，加入氯仿，使上清液三相分离后取水相，加入足量的乙醇使RNA沉淀，于纯化柱中洗脱RNA；最后加入RiboLock RNase Inhibitor保存RNA。使用1.5%琼脂糖进行凝胶电泳，检验RNA的完整性。如可见两条清晰的条带，则使用逆转录试剂盒GodlenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2（北京擎科新业生物技术有限公司）将RNA反转录为cDNA。

1.4 基因转录水平检测

使用相对定量RT-qPCR的方法检测Cytc、Apaf-1和Caspase-9基因的mRNA表达水平，利用Primer Premier 6设计Cytc、Apaf-1和Caspase-9的荧光引物，试验中用到的内参基因为β-肌动蛋白（β-actin）。内参基因的引物序列参考了陆路［7］的研究，Cytc、Apaf-1、Caspase-9及β-actin的基因序列见表1。RT-qPCR体系：L SYBRGREEN 10μL，模板cDNA 2μL，10μmol/μL上下游引物各1.0μL，用水补至20μL。RT-qPCR反应程序：95℃10 min；95℃10 s、60℃30 s，共40个循环。退火时收集荧光信号。试验所用引物序列见表3。

表3 试验所用引物序列

1.5 睾丸粗蛋白的提取与免疫印迹检测

将睾丸组织放入研钵中，加入液氮，打碎，转移到细胞裂解液中，室温静置10 min，12 000 r/min离心15 min，取上清液，将提取的粗蛋白分装，保存。将保存的粗蛋白煮沸，150 V电泳40 min，使蛋白分离，200 mA转膜1 h，使蛋白附着到甲醇处理过的PVDF膜上，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h后显色观察。使用北京安诺达生物科技有限公司生产的Cytc抗体和β-actin抗体对蛋白样品进行免疫印迹检测。

1.6 数据的统计分析

RT-qPCR扩增后采用△△Ct法计算。

内参基因均一化样本差异：△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因。

2个时期样本表达差异：△△Ct=△Ct处理样品-△Ct对照样品；倍数变化=2-ΔΔCt。

两组间结果比较采用t检验，P≤0.05表示差异显著，P≤0.01表示差异极显著。

免疫印迹所得的图像通过分析灰度值，计算不同时期的表达差异。

2 结果与分析

2.1 RNA浓度测定

试验提取的18个样品的总RNA浓度见表4，样品浓度由超微量分光光度计测量。

表4 总RNA浓度 mg·m L-1

2.2 Cytc基因的表达水平

Cytc基因在麝鼠非繁殖期的前列腺、精囊腺和睾丸中mRNA表达水平约为繁殖期的3.44，3.75，6.54倍，见图1，差异显著（P≤0.05）。熔解曲线见图2，表明反应过程中未出现明显的非特异性扩增。

图1 Cytc基因的表达水平

图2 Cytc基因熔解曲线

2.3 Apaf-1基因表达水平

Apaf-1基因在非繁殖期麝鼠前列腺、精囊腺和睾丸中的mRNA表达水平约为繁殖期的2.02，2.54，5.03倍，见图3，差异显著（P≤0.05）。熔解曲线结果见图4，表明反应过程中未出现明显的非特异性扩增。

图3 Apaf-1基因的表达水平

图4 Apaf-1基因熔解曲线

2.4 Caspase-9基因表达水平

Caspase-9基因在非繁殖期麝鼠前列腺、精囊腺和睾丸中的mRNA表达水平约为繁殖期的4.13，8.11，10.04倍，见图5，差异显著（P≤0.05）。熔解曲线见图6，表明反应过程中未出现明显的非特异性扩增。

图5 Caspase-9基因的表达水平

图6 Caspase-9基因熔解曲线

2.5 Cytc免疫印迹验证结果

Cytc在非繁殖期与繁殖期麝鼠睾丸的免疫印迹结果见图7。

图7 Cytc免疫印迹结果

繁殖期与非繁殖期麝鼠睾丸Cytc蛋白的相对灰度值见图8，可以看出Cytc蛋白在非繁殖期的表达水平高于繁殖期，二者间差异显著（P≤0.05），与其mRNA在两个时期的表达水平变化一致。

图8 Cytc灰度值

3 讨论

麝鼠是季节性多次发情繁殖的多胎次动物，一般6个月性成熟，性活跃期从3月持续到10月。由于中国东北地区气候较严寒，故而该地区麝鼠的繁殖期为每年4—9月中下旬［4］。麝鼠的生殖腺会随着繁殖发生规律性的变化，如睾丸会从3月起开始逐渐发育，5月达到最大，8月生殖腺开始逐渐萎缩，9月左右体积达到最小。通过解剖可以观察到，麝鼠前列腺以及精囊腺也会随着繁殖期的进行逐渐发育，繁殖结束后逐渐萎缩。本试验选取了麝鼠前列腺、精囊腺和睾丸周期变化过程中体积最大以及最小的两个时间点进行转录水平的比较分析。

Cytc即细胞色素C，是一种存在于线粒体膜间隙中的15 kD蛋白，可以从一种能与脱氧三磷酸腺苷激活Caspase-9酶原的凋亡细胞提取液中提纯出来［5］。当细胞受到各种外界刺激时线粒体会响应凋亡信号，细胞色素C会从线粒体膜间隙被释放到细胞浆中。在ATP存在的情况下，Cytc与Apaf-1结合。这种存在于胞质中的复合体会募集并激活酶原Caspase-9，形成凋亡体，凋亡体会激活下游的Caspase-3，从而引发级联反应，诱导细胞凋亡。范小瑞等［6］研究表明，热应激处理导致猪睾丸中Cytc和Caspase-3蛋白和mRNA表达水平升高。

Apaf-1是一种多结构域蛋白，包括Caspase募集结构域、中央核苷酸结合域和具有调控功能的多个WD40重复序列［7］。该重复序列可以提供与其他蛋白质结合的位点。Cytc与WD40重复序列结合时，Apaf-1发生结构变化，导致核苷酸结合位点暴露于dATP/ATP，发生寡聚，Apaf-1组装成轮状的凋亡体复合体。A.R.Noori等［7］的研究证明Apaf-1蛋白低表达，是凋亡体形成和凋亡信号的限制因子。Apaf-1的表达受转录和翻译水平的调控。Y.N.Li等［8］研究表明，Caspase-9酶原的激活和成熟Caspase-9的催化活性都严格依赖于凋亡体。

本研究结果显示，Cytc基因在非繁殖期麝鼠前列腺、精囊腺和睾丸中的mRNA表达水平约为繁殖期的3.44，3.75，6.54倍，睾丸中的转录水平变化最大。Apaf-1基因在非繁殖期麝鼠前列腺、精囊腺和睾丸中的mRNA表达水平约为繁殖期的2.02，2.54，5.03倍，睾丸中的转录水平变化最高。Caspase-9基因在非繁殖期麝鼠前列腺、精囊腺和睾丸中的mRNA表达水平约为繁殖期的4.13，8.11，10.04倍，睾丸中的转录水平变化最大。构成凋亡体基因的mRNA表达水平变化极为显著，并且变化规律一致，均为繁殖期表达水平低，非繁殖期表达水平高。对睾丸中Cytc的蛋白质表达水平用免疫印迹方法进行检验，Cytc蛋白的表达水平依然是非繁殖期高，与其mRNA的表达水平变化一致。此结果提示，在麝鼠前列腺、精囊腺和睾丸发育与萎缩的过程中，上述基因起着重要的调控作用。

在繁殖期，上述组织中Cytc等三个基因的表达水平低，凋亡体形成少，凋亡水平也相应低，使组织快速发育、体积逐渐增大。在非繁殖期，上述三个基因表达水平均显著上调，凋亡体形成增多，细胞凋亡水平加快，导致睾丸体积比繁殖期减小。

上述三个基因在前列腺、精囊腺和睾丸三个组织的表达水平比较结果显示，Cytc基因在繁殖期与非繁殖期麝鼠前列腺和精囊腺中的mRNA表达水平变化接近，而睾丸中的mRNA表达水平变化远高于二者。Apaf-1基因在繁殖期与非繁殖期麝鼠前列腺和精囊腺中的mRNA表达水平变化接近，睾丸的mRNA表达水平变化高于二者。推测前列腺与精囊腺相连，因此前列腺与精囊腺中的Cytc基因与Apaf-1基因的转录水平变化相似。Caspase9基因在繁殖期与非繁殖期麝鼠睾丸和精囊腺中的mRNA表达水平变化接近，远高于前列腺中的mRNA表达水平。推测由于睾丸与精囊腺是储存精子的场所，在繁殖期与非繁殖期体积变化显著，Caspase9基因转录水平变化较大。

王承敏［9］的研究表明，Pten-PI3K/Akt通路参与调控了大鼠睾丸凋亡的过程，并且Akt基因间接调控了Cytc基因，影响着凋亡体的形成。黄海等［10］研究证明PI3K/Akt通路也参与了前列腺细胞的凋亡调控。从而提示了线粒体凋亡途径中的相关基因，尤其是构成凋亡体的3个基因，在麝鼠睾丸与前列腺的凋亡过程中起到了重要的调控作用。

张宇等［11］研究表明，在繁殖期和非繁殖期麝鼠的前列腺组织中Bcl-2家族基因的转录水平出现了显著差异。Bcl-2家族基因参与细胞凋亡过程，以Bcl-2基因为代表的基因可以抑制细胞凋亡，而以Bax基因为代表的一类基因可以促进细胞凋亡。Bcl-2家族基因同时也是调控线粒体凋亡途径的关键基因，调控凋亡体的形成。这表明在前列腺凋亡的过程中，构成凋亡体的基因起促进组织凋亡的作用。

Cytc、Caspase-9和Apaf-1构成的凋亡体在线粒体介导的细胞凋亡途径中起着重要的作用，凋亡体作为细胞执行凋亡的重要标志物，可以响应细胞的凋亡信号，作为Caspase-9蛋白激活的平台，促使Caspase-9蛋白多聚活化，Caspase-9蛋白活化后激活下游的效应型Caspase蛋白，从而执行细胞凋亡。

综上所述，本试验通过对凋亡体3个基因的mRNA表达水平的比较分析，提示其在麝鼠前列腺、精囊腺和睾丸周期变化过程中可能具有重要的调控作用，这为进一步研究了解麝鼠繁殖腺发育、调控繁殖周期提供依据。