HPLC法测定维生素D3软胶囊中抗氧剂二丁基羟基甲苯的含量

周惠惠 胡立学 刘佳佳 梅兴国

【摘 要】 目的：建立测定维生素D3软胶囊中抗氧剂二丁基羟基甲苯（BHT）含量的方法。方法：色谱柱为DiamonsilC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水、甲醇-乙醇（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为278 nm，柱温为35 ℃，进样量20 μL。结果： BHT浓度在5.44～16.31 μg/mL范围内线性关系良好（r2=0.9999，n=5）;精密度、重复性、溶液稳定性试验的RSD均小于3%;平均回收率为98.2%，RSD为1.52%。结论：该方法简便、准确度高，可用于维生素D3软胶囊中BHT的含量测定。

【关键词】 二丁基羟基甲苯;含量测定;HPLC法

【中图分类号】R927.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）08-0026-04

Abstract：Objective To establish a method for the determination of the antioxidant dibutyl hydroxytoluene （BHT） in vitamin D3 soft capsules.Methods the chromatographic column was Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm， 5 m）， the mobile phase was methanol-water and methanol-ethanol （gradient elution）， the flow rate was 1.0 mL/min， the detection wavelength was 278 nm， the column temperature was 35 ℃， and the injection volume was 20 μL.Results The linear range of BHT was 5.44～16.31 μg/mL （R2=0.9997， n=5）.The quantitative limit and detection limit are respectively;The RSD of precision， repeatability and solution stability test were all less than 3%.The average recovery was 98.2% and RSD 1.13%.Conclusion The method is simple， reproducible and accurate， and can be used for the determination of BHT in vitamin D3 soft capsule.

Key words：Dibutyl Hydroxytoluene;Determination of Content;HPLC

二丁基羟基甲苯（Butylated hydroxytoluene，BHT）作为一种脂溶性抗氧剂，稳定性高，抗氧化能力强，是我国生产量最大的抗氧化剂之一，常用于食品、保健品、药品中[1]。2020版中国药典[2]中收录该品种的含量测定采用高效液相色谱法，也有文献[3-4]采用气相色谱法。本文参照2020版中国药典及相关文献[5-7]并在此基础上进行优化，建立了高效液相色谱法测定维生素D3软胶囊中抗氧剂BHT的含量，现报导如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 40D高效液相色谱仪（岛津公司）;XSE105电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多）;XW-80A涡旋混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.2 试药 甲醇为色谱纯（天津赛孚瑞科技有限公司）;乙醇为色谱纯（天津赛孚瑞科技有限公司）;纯化水（杭州娃哈哈集团有限公司）;二丁基羟基甲苯对照品（中国食品药品检定研究院，批号190065-201602）;维生素D3軟胶囊（批号200617、200712、200723，自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：DiamonsilC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：A相为甲醇-水（9∶[KG-*3/5]1）、B相为甲醇-乙醇（8∶[KG-*3/5]2），梯度洗脱（0～10 min时为A;10～30 min时为B;30～40 min时为A）;检测波长：278 nm;柱温：35 ℃;流速：1.0 mL/min;进样量：20 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的配制 称取BHT对照品约10mg置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为BHT储备液。精密吸取1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。[JP]

2.2.2 [JP+1]供试品溶液的配制 称取维生素D3软胶囊内容物适量（相当于BHT 0.2 mg）置20 mL容量瓶中，加适量甲醇溶解涡旋5 min，加甲醇稀释至刻度，摇匀，静置分层，取上清液过滤进样。[JP]

2.2.3 空白溶液的配制 按处方组成及工艺制备不含BHT的空白辅料，按“2.2.2”供试品溶液的配制方法进行配制空白溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 按照“2.1”色谱条件下，分别取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液进样检测，记录色谱图，观察在主峰出峰位置是否有干扰。结果显示，在278 nm处，供试品溶液中的BHT保留时间约为7 min与对照品溶液保留时间相同，空白溶液在主峰位置无干扰。色谱图如图1所示。

2.3.2 线性考察 精密称量BHT对照品约10.87 mg置100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制得108.7 μg/mL的对照储备液。用甲醇溶液逐级稀释，制得浓度分别为5.44 μg/mL、8.70 μg/mL、10.87 μg/mL、13.04 μg/mL、16.31 μg/mL的对照品溶液。按照2.3.2项的色谱条件进样，记录色谱图，以峰面积（y）对浓度（x）进行线性回归，得回归方程：y=10067.15x-1031.8[BF]，（[BFQ]R2=0.9999）。结果表明，在5.44～16.31 μg/mL范围内，BHT峰面积与浓度呈良好线性关系。如图2所示。

2.3.3 精密度试验 取对照品溶液（10 μg/mL）重复进样6次，记录峰面积。结果BHT峰面积RSD为0.30%，表明仪器精密度良好，色谱条件稳定。见表1。

2.3.4 重复性试验 取同一批的样品（批号为200617）平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项的色谱条件，记录峰面积，计算含量。结果RSD为1.02%，表明本方法重复性良好。见表2。

2.3.5 回收率试验 称取BHT对照品约10 mg置100 mL量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为BHT储备液溶液。精密吸取1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为BHT对照品溶液，平行配置2份。精密称量9份空白辅料（按处方比例不加入BHT）置50 mL量瓶，分3组，每组3份，各组分别精密加入BHT对照储备液4 mL、5 mL、6 mL，（分别相当于BHT处方量的80%、100%和120%），加入适量甲醇溶解并涡旋5 min，用同样的溶剂稀释并至刻度，静置分层，配制成低、中、高三种浓度的供试品溶液，取上清液过滤，按“2.1”项下色谱条件进样，计算回收率及RSD值。结果表明平均回收率98.2%，RSD为1.52%。见表3。

2.3.6 溶液稳定性 取自制样品（200723批）按“2.2.2”项制备成供试品溶液，分别于0、4、8、12、24 h，按“2.3.2”色谱条件进样检测，记录峰面积，计算RSD值。结果显示：BHT的RSD值为0.66，表明样品溶液在24 h内稳定。见表4。

2.4 样品含量测定 取三批样品（200617、200712、200723批）按照“2.2.2”项配制供试品溶液，按“2.1”项的色谱条件进样，计算含量。结果显示含量符合要求。见表5。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 用甲醇配制成一定浓度的二丁基羟基甲苯（BHT）对照品溶液，在200～400 nm之间进行紫外波长扫描。扫描结果显示，BHT在278 nm处有最大吸收峰，因此将选择278 nm为BHT含量测定检测波长。

3.2 流动相的选择 2020版中国药典BHT含量测定记录流动相为甲醇-水（9∶[KG-*3/5]1），但本制剂内容物中含有植物油，在BHT出峰附近有较大的杂质峰，因此，笔者选择流动相甲醇-水（9∶[KG-*3/5]1）及甲醇-乙醇（8∶[KG-*3/5]2）进行梯度洗脱，使植物油洗脱出来同时不干扰BHT的含量测定。

3.3 提取方法的选择 BHT可溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，不溶于水，本实验研究的是从植物油中提取BHT，笔者选择极性更大的甲醇作为提取溶剂，在提取次数上考察一次提取与三次提取BHT含量的多少，结果显示两者含量无明显差别，因此选择用甲醇一次提取的作为样品处理方法。

参考文献

[1]李永强，陈福新，陈琦.食品级抗氧化剂BHT国内市场应用情况[J].现代食品，2020（9）：68-69.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国（四部）[S].北京：中国医药科技出版社，2020：574.

[3]杨慧明，武克锋.气相色谱法测定抗氧剂BHT[J].甘肃化工，2003，17（1）：40-42.

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[5]朱碧君，李婷婷，孙会敏，等.HPLC法同时测定药用卤化丁基胶塞中5种抗氧剂和游离硫的含量[J].中国药房，2018，29（18）：2475-2479.

[6]王豪，罗志强，刘洋，等.HPLC同时测定度他雄胺软胶囊中度他雄胺及抗氧剂二丁基羟基甲苯的含量[J].中国药学杂志，2016，51（18）：1592-1595.

[7]王彩媚，伍伟聪，王淼.高效液相色谱法测定复方醋酸曲安奈德溶液中2种抗氧剂含量[J].中国药业，2019，28（22）：25-27.

（收稿日期：2020-10-04 編辑：刘 斌）