RhoA激酶的硫巯基化修饰在硫化氢抗大鼠神经细胞缺氧性损伤中的作用

谢伟明，陈志武，郭 岩

(安徽医科大学药理学教研室，安徽 合肥 230032)

硫巯基化(S-sulfhydration)是继乙酰化(acetylation)和磷酸化(phosphorylation)等之后发现的一种新的蛋白质翻译后修饰方式[1]，硫巯基化修饰可以被二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)等还原剂抑制[2]。

硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)是机体内一种重要的气体信号分子[3]，与多种生理及病理过程有关。H2S具有抗神经细胞凋亡、抗炎症反应、保护血脑屏障等效应[4]。有研究表明，H2S可通过硫巯基化修饰靶蛋白的半胱氨酸残基，使半胱氨酸的-SH基团转化为-SSH或过硫酸盐基团，改变靶蛋白的生物学功能，如H2S硫巯基化修饰ATP敏感性钾离子(KATP)通道蛋白的半胱氨酸残基，进而影响该通道开放[5]。

RhoA-Rho激酶(Rho-associated coiled-coil forming protein kinase，ROCK)信号转导通路是机体内一种与细胞的生长、增殖和分化等功能有关的信号通路，与高血压和缺血性脑损伤等血管性疾病密切相关。ROCK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，有ROCK1和ROCK2两种亚型，ROCK2主要表达在大脑、心脏和肌肉中[6]。有研究表明ROCK2激活促进缺血性神经元损伤，而抑制ROCK2活性或者降低ROCK2蛋白表达，可减轻神经元损伤[7]。我们前期研究发现H2S对小鼠脑缺血损伤具有明显保护作用，并可抑制小鼠脑血管平滑肌细胞中ROCK2活性[8]。但是，H2S抑制ROCK2活性的机制至今未见明确报道。鉴于ROCK2分子结构中的半胱氨酸富集的锌指样结构域(cysteine-rich zine finger-like motifdomain，CRD)中富含半胱氨酸残基[9]，H2S是否通过硫巯基化修饰来抑制神经细胞中ROCK2活性抗神经细胞H/R损伤？因此，本研究拟探讨H2S是否可通过抑制ROCK2对大鼠神经细胞H/R损伤产生保护作用及其ROCK2抑制作用的硫巯基化修饰机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂ROCK2抗体，购自Abcam公司，批号：125025；NaHS，购自Sigma公司，批号：#SHBF1746V；链霉亲和素琼脂糖珠，购自北京博尔西科技有限公司，批号：B190319；ROCK2活性试剂盒，购自江苏酶免实业有限公司，批号：0069R1；Biotin-HPDP，购自APExBIO公司，批号：A800831337769；细胞凋亡试剂盒，购自北京四正柏生物有限公司，批号：20200820；二硫苏糖醇(DTT)，购自阿拉丁试剂有限公司，批号：D8220。

1.2 仪器流式细胞仪(美国BD公司)；凝胶电泳仪和电泳槽(美国BIO-RAD公司)；TGL-16H超速冷冻离心机(珠海黑马仪器有限公司)；细胞培养箱(美国Thermo公司)

1.3 动物SPF级SD大鼠新生鼠，购自安徽医科大学实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK(皖)2017-001。

1.4 方法

1.4.1原代培养大鼠海马神经细胞[10]取新生24 h内的SD大鼠，在麻醉状态下断头取脑并剥离海马组织，0.125%胰酶液消化20 min，加入10% FBS的DMEM/F12完全培养基，巴氏吸管将组织吹散，70 μm细胞过滤器过滤，1 000 r·min-1常温离心5 min并留沉淀。加入完全培养基重悬细胞，调整细胞数目为1×107个·L-1，接种于预先用多聚赖氨酸包被好的6孔板中，24 h后用专用培养基(Neurobasal+2% B27+0.5 mmol·L-1L-glutamine+1%青霉素-链霉素溶液)半量换液，每隔3 d全量换液。

取培养8 d的海马神经元细胞，用4%的多聚甲醛室温固定10 min，PBS溶液清洗后，加0.3% Tritonx-100放置30 min。弃掉Tritonx-100，清洗3遍，滴加10%山羊血清工作液封闭30 min。加1 ∶100稀释的一抗MAP2，4 ℃放置过夜，次日清洗后滴加同样稀释倍数的FITC标记山羊抗兔IgG(H+L)荧光二抗，室温避光放置1 h，于激光共聚焦显微镜下观察拍照，进行海马神经元细胞的鉴定。

1.4.2硫巯基化蛋白的分离纯化 采用改良生物素转换法[1]分离纯化硫巯基化蛋白。在培养8 d的海马神经元细胞中分别加入50、100、200 μmol·L-1NaHS或等体积的生理盐水(NS)培养24 h后，调节细胞悬液为每mL含有1×105个神经元，取500 μL细胞悬液置于6孔培养板中，加入100 μL的蛋白裂解液，置冰盒上裂解30 min，离心取上清并进行蛋白定量。将200 μL上清液加入2 mL离心管中，再加入800 μL甲基硫代磺酸甲酯(Methyl methanethiosulfonate，MMTS)和HENS缓冲液配制的终止缓冲液，50 ℃恒温水浴30 min，封闭剩余的游离巯基。加入1 mL-20 ℃预冷的丙酮静置30 min后15 000 r·min-14 ℃离心20 min。加入1 mL HENS缓冲液将留下的沉淀吹打溶解。再加入250 μL Biotin-HPDP工作液混匀，室温避光放置过夜。次日再加满-20 ℃预冷的丙酮，-20 ℃冰箱中静置30 min，立即12 000 r·min-14 ℃离心20 min，弃上清。加入1 mL HENS缓冲液吹打溶解，加入50 μL链霉亲和素琼脂糖珠，室温避光放置24 h。再12 000 r·min-1离心2 min后弃上清，用HENS缓冲液重悬琼脂糖珠并反复离心洗涤3次，用洗脱缓冲液洗脱琼脂糖珠后得到纯化的硫巯基化蛋白。

1.4.3ROCK2或硫巯基化ROCK2(SSH-ROCK2)的蛋白含量检测 神经元总蛋白或硫巯基化蛋白中的ROCK2含量分别用Western blot法测定。将100 μg的总蛋白或硫巯基化蛋白置100 ℃变性后，在12% SDS聚丙稀酰胺凝胶中电泳后将蛋白转膜至PVDF膜。5%脱脂牛奶中封闭1.5 h，ROCK2一抗孵育过夜。次日加入HRP标记的二抗孵育1 h。TBST洗膜后用ECL化学发光显色液显影并拍照以兔抗β-actin多克隆抗体为内参照，Image J进行灰度值分析。

1.4.4ROCK2活性检测 将培养8 d的海马神经元细胞随机分为NS对照组和NaHS(200 μmol·L-1)组。NaHS或生理盐水处理24 h后，将NaHS组进行硫巯基化蛋白分离纯化。采用Western blot法定量分析各组ROCK2蛋白的浓度，以灰度值的比值来调整ROCK2蛋白的浓度，待浓度一致后再进行ROCK2活性检测。将蛋白样品加入到96孔板中，并设置空白孔和标准孔，按试剂盒说明书进行操作，以空白孔调零，450 nm波长测吸光度。

1.4.5神经细胞缺氧复氧损伤模型的建立 将原代海马神经细胞随机分为正常对照组、模型组、NaHS(50、100、200 μmol·L-1)组、硫巯基化抑制剂DTT组以及NaHS(200 μmol·L-1)+DTT组。除正常对照组外，细胞预处理24 h后弃去培养基加入缺氧液，置于90% N2-10% CO2三气培养箱中孵育4 h，再更换成完全培养基置于正常三气培养箱(37 ℃、5%CO2)孵育12 h，进行后续实验。

1.4.6CCK-8法检测细胞活力 取缺氧4 h/复氧12 h铺满96孔板(100 μL/孔)的神经元，每孔加入10 μL CCK-8试剂，培养箱中孵育1 h后用酶标仪测定450 nm处的吸光度，计算细胞活力。

1.4.7检测培养上清中LDH、NSE水平 使用试剂盒检测细胞培养上清中LDH和NSE活性。

1.4.8细胞凋亡检测 将细胞用不含EDTA的胰酶消化吹打分离出后，加入1 ∶3稀释的结合缓冲液。将5 μL Annexin V和10 μL碘化丙啶(PI)加入100 μL细胞悬液中避光放置5 min，立即检测各组凋亡率。

2 结果

2.1 原代培养大鼠海马神经元的鉴定取生长8 d的大鼠海马细胞，用神经元特异性标志物MAP2免疫荧光法进行细胞鉴定。如Fig 1所示，原代培养的细胞的细胞核被DAPI染成蓝色，和阴性对照组相比，胞体和轴突经MAP2抗体染色呈绿色荧光，结果表明所培养的大鼠海马细胞为神经元。

2.2 NaHS对大鼠海马神经元H/R损伤的影响

2.2.1NaHS对细胞活力及LDH和NSE活性的影响 如Fig 2A所示，与正常对照组相比，H/R模型组细胞活力显著降低(P<0.01)，而给予外源性H2S供体NaHS 100和200 μmol·L-1可显著提高H/R损伤导致的细胞活力降低(P<0.01，与模型组相比)；Fig 2B和Fig 2C显示，相比正常对照组，H/R模型组细胞上清中LDH和NSE活性有明显提高，提示H/R损伤细胞致NSE和LDH漏出增多。相比模型组，100和200 μmol·L-1NaHS可降低H/R导致的神经细胞LDH和NSE的漏出(P<0.01)，50 μmol·L-1NaHS也可明显降低神经细胞H/R后培养上清中NSE活性。结果表明H2S对大鼠海马神经元H/R损伤有明显的保护作用。Fig 2A、Fig 2B和Fig 2C还显示，联合应用硫巯基化修饰阻断药DTT显著阻断200 μmol·L-1NaHS对H/R损伤诱导的细胞活力降低和上清液中LDH和NSE活性增高的抑制作用(与200 μmol·L-1NaHS组相比，P<0.01)，对DTT单独应用对H/R损伤诱导的大鼠海马神经元细胞活力降低和细胞上清液中LDH和NSE活性增高无明显的影响。以上结果表明，外源性H2S对大鼠海马神经元H/R损伤的保护机制可能与蛋白质的硫巯基化修饰有关。

2.2.2NaHS对细胞凋亡的影响 流式细胞术检查结果(Fig 3A)显示：H/R模型组细胞凋亡率明显高于正常对照组(P<0.01)，而50、100、200 μmol·L-1NaHS均可降低H/R对细胞凋亡率的影响(与模型组组相比，P<0.05)。结果表明H2S可抑制H/R损伤导致的大鼠海马神经元细胞凋亡。与细胞活力及培养上清中LDH和NSE活性的改变相似，联合应用DTT可降低200 μmol·L-1NaHS对H/R损伤诱导的大鼠海马神经元凋亡的抑制作用(与200 μmol·L-1NaHS组相比，P<0.01)，而DTT单独应用同样对H/R损伤诱导的大鼠海马神经元凋亡无明显的影响。结果表明外源性H2S抗大鼠海马神经元H/R损伤的机制与硫巯基化修饰有关。

Fig 1 Identification of rat neurons by MAP2 under fluorescence microscope (×100)

Fig 2 Protection of NaHS on H/R injury in rat neurons and effect of S-sulfhydration on protection n=6)

2.3 NaHS对大鼠海马神经元ROCK2蛋白表达和活性的影响原代培养海马神经细胞，并给予不同浓度NaHS(50、100、200 μmol·L-1)。Western blot结果(Fig 4A)表明，与NS对照组相比，100和200 μmol·L-1NaHS可以降低大鼠海马神经细胞中ROCK2蛋白的表达(P<0.01)；Fig 4B显示200 umol·L-1NaHS可以降低海马神经细胞中ROCK2活性(与NS对照组相比，P<0.01)。结果表明H2S对大鼠海马神经细胞中ROCK2蛋白表达和活性均有明显抑制作用。

Fig 4 Effects of NaHS on ROCK2 protein expression and activity in rat neurons n=3)

2.4 NaHS促进大鼠海马神经元中ROCK2的硫巯基化原代培养海马神经细胞，并给予不同浓度NaHS(50、100、200 μmol·L-1)，24 h后，经过生物素化处理得到各组硫巯基化修饰蛋白，以硫巯基化修饰ROCK2蛋白量和总ROCK2蛋白量二者比值来定量分析NaHS对硫巯基化修饰ROCK2蛋白的影响，结果如Fig 5所示，与NS对照组相比，NaHS 100和200 μmol·L-1孵育24 h可提高原代培养的大鼠海马神经元中硫巯基化ROCK2(SSH-ROCK2)蛋白的含量(P<0.01)，表明H2S可促进海马神经元中ROCK2蛋白的巯基化修饰。

Fig 5 Effect of NaHS on protein level of S-sulfhydration ROCK2(SSH-ROCK2)in rat neurons n=3)

2.5 硫巯基化对ROCK2活性的影响为观察硫巯基化对ROCK2活性的影响，本研究从分别对照组和NaHS处理组海马神经元中提取总蛋白，分离纯化NaHS处理组细胞的硫巯基化蛋白，运用Western blot调整对照组总蛋白中的ROCK2蛋白含量与NaHS处理组硫巯基化蛋白中的SSH-ROCK2蛋白含量相等，继而测定ROCK2活性。结果如Fig 6所示，200 μmol·L-1NaHS处理组细胞中的SSH-ROCK2活性明显低于对照组细胞中的ROCK2活性，提示ROCK2硫巯基化修饰可明显降低其活性。

Fig 6 Effect of S-sulfhydration on ROCK2 activity in rat neurons n=3)

3 讨论

脑缺血/再灌注损伤是目前临床上高致残率、高致死率的主要疾病之一[11]。脑缺血/再灌注损伤以及细胞的H/R损伤均可导致细胞膜破损，造成神经细胞内的一些重要酶，比如LDH和NSE的外漏[12]。本研究在大鼠海马神经元H/R模型上，发现外源性H2S供体NaHS明显抑制H/R损伤诱导的细胞培养清液中LDH和NSE活性增高，表明H2S可抑制H/R损伤导致的大鼠海马神经元中LDH和NSE的外漏。同时，NaHS还可抑制H/R损伤诱导的海马神经元的活力降低和细胞凋亡，进一步明确H2S对大鼠海马神经元H/R损伤有明显的保护作用。

Chang等[13]发现Rho/ROCK2信号通路参与了脑缺血/再灌注损伤，而抑制ROCK2蛋白的表达可抑制脑缺血/再灌注后的神经细胞凋亡。本研究发现NaHS 100和200 μmol·L-1对大鼠海马神经元中ROCK2蛋白表达和活性有明显的抑制作用，这与我们以前报道的H2S可抑制小鼠平滑肌细胞中ROCK2活性[9]是一致的。因此，我们的结果提示H2S对海马神经元H/R损伤保护作用可能与抑制ROCK2蛋白表达和活性有关。但是H2S抑制ROCK2活性的机制需要进一步阐明。

近年来的研究表明，H2S可将某些靶蛋白半胱氨酸残基的SH基团转化为-SSH或过硫酸盐基团，对蛋白质结构和功能产生调节作用，这被称为硫巯基化(S-sulfhydration)修饰[5]。硫巯基化修饰是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰方式，如H2S通过硫巯基化修饰血管平滑肌细胞的KATP通道，可引起通道的开放和钾离子外流而导致血管舒张[14]。RhoA-ROCK信号转导通路是一种重要的细胞内信号通路，参与了多种细胞功能的调节。ROCK是RhoA最直接的效应分子，在脑细胞中，以ROCK2表达为主。鉴于ROCK2分子结构中含有较多的半胱氨酸残基[15]，H2S有可能通过半胱氨酸残基来硫巯基化修饰转录表达的ROCK2，并进而影响ROCK2活性。本研究通过改良生物素转换法[1]分离纯化硫巯基化蛋白，并结合Western blot法检测了硫巯基化蛋白中的SSH-ROCK2，结果表明100、200 μmol·L-1NaHS可以增加大鼠海马神经元中的SSH-ROCK2蛋白水平，证实了H2S可硫巯基化修饰大鼠海马神经元中的ROCK2。靶蛋白翻译后的修饰可影响其功能。本研究进一步发现NaHS组大鼠海马神经元中的SSH-ROCK2活性明显低于对照组中的ROCK2活性，表明H2S硫巯基化大鼠海马神经元中的ROCK2，并抑制其活性，这可能是H2S保护大鼠海马神经元H/R损伤作用的重要机制之一。

硫巯基化修饰可被DTT等还原剂所逆转[2]。本研究在在大鼠海马神经元H/R模型上，观察到了DTT可明显地阻断200 μmol·L-1NaHS对H/R损伤诱导的细胞活力降低、细胞中LDH和NSE外漏及细胞凋亡的抑制作用，结果提示硫巯基化修饰参与了H2S对大鼠海马神经元H/R损伤的保护作用，这与H2S硫巯基化ROCK2并抑制其活性的结果是一致的，但也不能排除H2S对如KATP通道等其它蛋白质的硫巯基化是否也参与了其保护作用，今后研究需要进一步明确。本研究首次阐明了H2S介导的硫巯基化修饰发生在RhoA-ROCK信号通路RhoA激酶2(ROCK2)中。也首次阐明了H2S介导的ROCK2硫巯基化修饰是H2S对大鼠海马神经元H/R损伤产生保护作用的机制之一，为脑缺血/再灌注损伤的临床研究提供了一个新的方向。

综上所述，本研究发现H2S对大鼠海马神经元H/R损伤有明显的保护作用，其机制与硫巯基化修饰致ROCK2活性降低及ROCK2蛋白表达减少有关。