TGF-β1诱导肝星状细胞活化调控肝癌的炎症和免疫反应

程变巧 黄志腾 林园香

原发性肝癌是严重危害人类健康的第4大恶性肿瘤之一，据世界卫生组织统计，每年仍有一定的比例发生[1-2]。目前研究认为肝癌的发生离不开炎症和癌细胞的免疫逃逸[3]，慢性炎症通过抑制免疫监测(immunosurveillance)来促进癌症产生。因肝癌中常见原因是慢性乙型病毒性肝炎，因此提出没有炎症，就没有肿瘤的假说。在我国，慢性乙型病毒性肝炎—肝硬化—肝癌仍是肝癌发生的三部曲。肝脏内的炎症一般经过5年左右就会向肝硬化、肝癌的方向发展。其中炎症可以启动肝星状细胞的活化[4-6]，后者可以引起肝硬化和肝癌。因此抑制肝星状细胞的活化可望降低肝癌的发生。本课题通过改变肝星状细胞与肝癌细胞共培养体系，观察对肝癌的炎症和免疫的影响，预期为肝癌的生物学治疗提供新的治疗策略。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人源LX-2及SMMC7721细胞株均由孟超肝胆医院重点实验室惠赠，本课题在本中心完成。用含有10%胎牛血清(ExCell FND500)+1%双抗(Hyclone SV30010)的DMEM(Hyclone SH30022.01)高糖培养基，于37℃、5%CO2的培养箱中培养，根据生长情况进行传代。

把LX-2肝星状细胞系以3×105个/孔接种于六孔板中12 h后，加入10μg/L TGF-β1[4]24 h后，离心，收集上清液，并加入到预先生长率达60%的SMMC7721细胞中继续培养48 h，加入Disitetide(HY-P0118)12 h后进行后续研究。

1.2 EILSA检测 按照操作说明书，采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测白细胞介素-8(IL-8)与白细胞介素-10(IL-10)的表达。取外周血2 000 rpm离心10 min，取上清液待检。具体步骤如下，加样：每个血清样本设置3个孔，每孔加标准液100μL，37℃放置40 min；洗板：洗涤液洗4～6次，滤纸上印干(下同)；加蒸馏水25μL，一抗25μL，充分混匀后37℃放置20 min；洗板：同上；每孔加酶标抗体100 U 37℃放置10 min；洗板：同上；每孔加底物100μL于37℃暗处15 min；加100μL终止液混匀；30 min内在酶标仪450 nm处测吸光值(OD值)。

1.3 流氏细胞术 单细胞悬液制备：分别取SMMC7721、LX-2＋SMMCM7721、Disitetide+LX-2＋SMMCM7721细胞，进行胰酶终止消化、离心以及PBS洗涤后，弃去上清液，用PBS重悬细胞，调整细胞浓度为106/100μL，取100μL细胞进行实验。表面染色：加入FITC标记抗人CD4、PE标记抗人CD25各20μL于上述细胞中，轻轻涡旋，4℃避光孵育30 min；胞内染色：每管加入1 mL 1xFix/Perm(破膜固定剂)工作液，涡旋3 s，避光4℃孵育40～50 min；再加入1 mL 1xPerm/Wash，350 g，4℃，离心6 min，弃上清液；每管加入100μL PBS重悬细胞；上流式细胞仪(BD FACSVerse)检测CD4+、CD25+细胞比例。1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。计量资料以(±s)表示，计量资料数据符合正态分布采用单因素方差分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF-β1诱导LX-2活化上调α-SMA表达

用10μg/L TGF-β1刺激LX-2细胞，用α-SMA的表达情况观察LX-2的活化程度。结果发现，在用10μg/L TGF-β1组α-SMA基因和蛋白表达水平均较0μg/L TGF-β1表达水平高，且两组间比较，P＜0.05。结果提示TGF-β1刺激LX-2细胞的活化。见图1。

图1 TGF-β1诱导LX-2活化后上调α-SMA表达。

2.2 活化的LX-2与SMMC7721细胞共培养促进肝癌的炎症反应 活化的LX-2细胞和SMMC7721细胞共培养后，用肝星状细胞抑制剂Disitetide处理共培养细胞，观察LX-2对SMMC7721炎症反应的影响，结果见表1。在共培养细胞内IL-8与IL-10表达水平均呈现上调表达，与SMMC7721比较，P均＜0.05。随后用TGF-β1抑制剂Disitetide处理共培养细胞，随后发现IL-8与IL-10表达水平均呈现下调表达，三组间比较，P均＜0.05。这说明肝星状细胞的活化程度调控着肝癌的炎症反应。

表1 炎症介质在活化的LX-2与SMMC7721共培养体系中表达(±s) 单位：μmol/L

表1 炎症介质在活化的LX-2与SMMC7721共培养体系中表达(±s) 单位：μmol/L

注：IL-8和IL-10组各组间比较，P＜0.05。

项目 SMMC7721 LX-2+SMM C7721 干预组 F值 P值?IL-8 21.83±0.42 41.50±1.43 25.44±0.93 318.72＜0.001 IL-10 19.2±0.29 24.99±0.11 21.65±0.33 368.32＜0.001

2.3 活化的LX-2和SMMC7721细胞共培养可以促进肝癌的免疫反应 活化的LX-2细胞和SMMC7721细胞共培养后，用肝星状细胞抑制剂Disitetide处理共培养细胞，流式细胞术观察CD4+CD25+T细胞处理前后的表达变化。结果见图2，在共培养细胞中CD4+CD25+T细胞(1.57%)较SMMC7721细胞中表达(0.46%)明显增加(P＝0.003)；在Disitetide干预后表达稍有下降(1.2%)，与共培养组比较，P＝0.025；与SMMC7721组比较，P＝0.130。从上述结果表明，活化的LX-2细胞可以上调SMMC7721细胞的免疫活性。

图2 活化的LX-2和SMMC7721细胞共培养后上调CD4+CD25+T细胞的表达

3 讨论

肿瘤微环境(TME)是肿瘤细胞赖以生存和发展的复杂环境，而HCC的慢性炎症是复杂的肿瘤微环境的重要组成成分之一，其中包括炎症/免疫细胞和介质。因此推测，HCC转移的生物学行为和恶性预后可能被局部的炎症状态所决定。最近越来越多的证据也提示，在肝癌形成过程中，炎症/免疫细胞活化，并相互协作，获得促瘤活性，从而导致肿瘤的恶性后果。在这些成分中肝星状细胞(HSCs)是免疫微环境中不可或缺的一种炎症细胞，HSC的活化，引起一些活化信号分子如：转化生长因子(TGF)-β、肝细胞生长因子(HGF)和血小板源性生长因子(PDGF)的表达增加，在肿瘤发展和纤维化过程中起到重要作用。与各种免疫活性细胞和肿瘤细胞相互作用，发挥其促瘤作用[7-8]。

优化微环境或可暂缓肝癌必死之局[9]。如何调控肝癌的肿瘤微环境是目前研究的热点和重点。基于HSC在肝癌中的作用特点，本课题通过调控HSC的活性表达来观察肝癌微环境中炎症和免疫变化。根据前期实验结果，我们首先用TGF-1诱导LX-2的活化，进而对活化的LX-2细胞进行血清收集，进而与SMMC7721细胞进行共培养。分别用流式细胞术和ELISA技术观察了共培养体系中LX-2对SMMC7721炎症免疫的改变情况。IL-8和IL-10是巨噬细胞和上皮细胞等分泌的细胞因子，主要调节细胞的生长与分化，参与炎性反应和免疫反应，是目前公认的炎症与免疫抑制因子。研究认为CD4+、CD25+调节性T细胞主要抑制肿瘤细胞的免疫反应，引起肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，从而促进肿瘤的发生和发展[10-12]。我们课题组研究结果发现，在LX-2刺激的共培养组，IL-8和IL-10的表达水平均较SMMC7721肝癌细胞组表达上调，CD4+、CD25+调节性T细胞在淋巴细胞中比例也明显升高。为了进一步探讨LX-2对SMMC7721的调控机制，我们用TGF-β1抑制剂Disitetide处理共培养细胞，目的是抑制LX-2的活化观察共培养体系中炎症免疫的改变。结果发现，干预后的IL-8和IL-10的表达水平较干预前表达下降，较SMMC 7721肝癌细胞组表达下调不显著(P＝0.130)，CD4+、CD25+调节性T细胞在淋巴细胞中比例较共培养组也明显下降。这说明阻断TGF-β1信号通路可能是阻断Treg功能以增强抗肿瘤反应的有效策略[13-15]。从上述结果中初步说明活化的LX-2细胞对肝癌细胞SMMC7721具有显著的促进炎症反应的提高免疫抑制作用，从而影响着肝癌的侵袭和转移等生物学行为。

基于上述的研究结果，我们已经明确肝癌体内存在免疫和炎症发应，HSC活化对肝癌的上述机制具有促进作用。但活化的HSC是如何调控肝癌微环境中的炎症和免疫的，对肝癌增生、凋亡、侵袭和转移的作用机制不明。下一步有望对肝癌炎症和免疫的调控机制的研究来揭示肝癌发生发展的生物学功能。