利用CRISPR/Cas9系统检测果蝇细胞中组蛋白甲基化修饰对20E信号传导的调控

张文豪, 龙诗慧, 倪伊璐, 张佳慧, 李 胜,2, 李 康,2,*

(1.华南师范大学生命科学学院, 广东省昆虫发育生物与应用技术重点实验室, 昆虫科学与技术研究所, 广州 510631；2.梅州市华师昆虫发育生物学与应用技术重点实验室广梅园研发中心, 广东梅州 514779)

CRISPR/Cas9作为一种RNA引导的基因组靶向编辑技术，由导向RNA(single guide RNA, sgRNA)与带有前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)区的靶标基因DNA 片段匹配，指导Cas9蛋白对基因组序列进行识别和切割，进而对基因进行编辑(Brounsetal., 2008; Garneauetal., 2010)。该技术已被广泛应用于基因敲除、基因修复和基因敲入等操作。在昆虫中，该技术首先在双翅目物种果蝇Drosophila和埃及伊蚊Aedesaegypti(Gratzetal., 2013; Bassettetal., 2014; Basuetal., 2015; Halletal., 2015)，鳞翅目物种家蚕Bombyxmori、柑橘凤蝶Papilioxuthus及金凤蝶P.machaon(Wangetal., 2013; Lietal., 2015)中被报道，随后陆续应用于赤拟谷盗Triboliumcastaneum、小菜蛾Plutellaxylostella、斜纹夜蛾Spodopteralitura、棉铃虫Helicoverpaarmigera和飞蝗Locustamigratoria等物种(Gillesetal., 2015; Huangetal., 2016; Li Yetal., 2016; Wangetal., 2016; Zhuetal., 2016; 童晓玲等, 2018)。

组蛋白甲基化修饰属于表观调控，参与调控基因的转录表达，在多种信号通路包括细胞分裂、分化和凋亡等方面起到重要的调节作用(Taniguchi and Moore, 2014; Kangetal., 2017)。共价修饰例如甲基化、乙酰化和磷酸化等发生在组蛋白游离在外的N端(Lawrenceetal., 2016)。组蛋白是染色质上核小体的主要成分，核小体是由2个H2A、2个H2B、2个H3和2个H4组蛋白组成的八聚体和147 bp环绕的DNA。组蛋白H3和H4的甲基化修饰研究较多，由保守的组蛋白甲基转移酶/去甲基化酶(histone methyltransferase/histone demethylase, HMT/HDMS)进行修饰。H3K4(组蛋白H3氨基端4号位赖氨酸)，H3K36，H3R2(组蛋白H3氨基端2号位精氨酸)和H3R3甲基化修饰激活基因表达，H3K9，H3K27和H4K20甲基化修饰导致基因沉默(Yunetal., 2011)。

蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)是一种类固醇激素，主导昆虫蜕皮、变态和生殖等生理过程(Riddifordetal., 2000; Yin and Thummel, 2005; Bondetal., 2010)。20E与其受体EcR-USP异源二聚体结合后形成配体-受体复合物20E-EcR-USP，获得DNA结合活性，通过与靶基因启动子上的EcRE结合，启动初级应答基因(Br-C,E74,E75和E93等)的转录表达，随后触发自噬相关基因(Atg)以及天冬氨酸凋亡酶编码基因Dronc和Drice及死亡激活因子reaper和hid的表达，最终导致昆虫变态过程中细胞自噬和凋亡的发生(Spindleretal., 2009; 李康等, 2011; Li Ketal., 2016; 龙诗慧等, 2019)。在果蝇中，已有报道组蛋白赖氨酸甲基转移酶Trr可以与EcR结合，并且对Br-C响应20E的启动子区域进行H3K4三甲基化，促进20E对Br-C的转录激活(Sedkovetal., 2003)。组蛋白精氨酸甲基转移酶Carmer与EcR结合后，促进20E激活凋亡因子的表达，其功能丧失可以阻断20E诱导的细胞凋亡(Cakourosetal., 2004)。相反地，另外一种组蛋白精氨酸甲基转移酶DART1作为EcR的共阻遏因子发挥转录抑制的功能，敲低其表达可以增强20E应答元件EcRE的活性(Kimuraetal., 2008)。本研究将组蛋白甲基转移酶的sgRNA序列插入到牛津大学实验室构建的敲除载体pAc-sgRNA-Cas9骨架中，以修饰H3K4甲基化的Trr正调控20E对Br-C的转录诱导为阳性对照，验证敲除系统是否可以有效地在黑腹果蝇Drosophilamelanogaster细胞中突变靶基因；此外，通过该敲除系统研究组蛋白甲基转移酶是否调控20E响应元件EcRE的活性，对后续组蛋白甲基化修饰调控20E信号传导的研究提供理论基础。

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1 材料与方法

1.1 供试细胞与试剂

黑腹果蝇Kc细胞为本实验室保存，利用添加5%澳洲胎牛血清(Gibco, 美国)的施耐德培养基(Gibco, 美国)于27℃恒温培养箱中培养(Heetal., 2014)。

pAc-sgRNA-Cas9敲除骨架载体订购于addgene(https:∥www.addgene.org/)，为牛津大学Liu实验室构建(Bassett and Liu, 2014)，用于构建黑腹果蝇组蛋白甲基转移酶的敲除载体。带有连续4个拷贝20E应答元件EcRE序列的荧光素酶载体PGL3-4×EcRE为本实验构建(Guoetal., 2012)，PGL4-Rluc作为内参载体，用于细胞中双荧光素酶活性检测实验。pAc-sgRNA-Cas9载体带有Ac5启动子表达的Cas9蛋白，同时反向插入dU6-2启动子表达的sgRNA序列。为了方便插入目的基因的靶向序列，两段反向的BspQI识别位点CTTCTCG设计在dU6-2启动子和sgRNA序列之间，通过BspQI酶切之后，形成带有dU6-2启动子-AAG和sgRNA-GTT粘性末端的线性质粒。在该实验室提供的果蝇全基因sgRNA库(Bassettetal., 2014)中查询目的基因20 nt(N20)的靶向序列，合成带有粘性末端的-TTCGN20-引物和N20反向互补-CN20CAA引物，通过退火形成目的基因的双链靶向DNA序列，随后利用T4 DNA连接酶与BspQI酶切线性化的pAc-sgRNA-Cas9载体连接，最终获得目的基因的敲除载体(图1)。选取发生甲基化修饰较多的H3K4和H3K9位点的5个甲基转移酶基因[trr,Mes-4,ash1,Su(var)3-9和egg]作为研究对象，将每个甲基转移酶基因和gfp的sgRNA靶向序列(表1)按照上述方法构建到pAc-sgRNA-Cas9载体骨架中，获得pAc-gfp/trr/Mes-4/ash1/Su(var)3-9/egg-sgRNA-Cas9敲除质粒，进行果蝇Kc细胞中的敲除实验。

1.2 组蛋白甲基转移酶及其修饰位点查询

果蝇组蛋白甲基转移酶及其催化组蛋白H3/H4的氨基位点均从Flybase网站(http:∥flybase.org/)查询并分析。

此次新研究为脑损伤治疗方案提供了一种新的思路：在康复治疗时，应该考虑对大脑进行适当的刺激，而不是单纯让患者静养。

1.3 载体构建

主要试剂: 蜕皮激素(纯优生物, 上海)，5-脱氧-5-甲基胞苷(5-deoxy-5-methylthioadenosine, MTA)(MCE, 美国)，BspQI限制性内切酶(Thermo, 美国)，T4 DNA连接酶(TaKaRa, 大连)，TaqTM酶(TaKaRa, 大连)，pMDTM18-T克隆试剂盒(TaKaRa, 大连)，去内毒素质粒和基因组抽提试剂盒(Promega, 美国)，Effectene转染试剂(Qiagen, 美国)，双荧光素酶检测试剂盒(Dual-Luciferase Report Assay System)(Promega, 美国)，Trizol(Invitrogen, 美国)，M-MLV(RNase H-)反转录试剂盒(TaKaRa, 大连)，SYBR-Green Mix(Bio-Rad, 美国)，化学发光 HRP 底物(Millipore, 美国)。

结果如图2所示，带有trr靶标sgRNA序列的pAc-trr-sgRNA-Cas9质粒转染黑腹果蝇Kc细胞48 h后，抽提基因组进行PCR，随后利用TA克隆进行测序，结果显示：与转染pAc-gfp-sgRNA-Cas9相比，转染pAc-trr-sgRNA-Cas9的PAM区附近序列均有碱基突变，缺失和插入现象发生(图2: A)；trr敲除后添加20E处理4 h，qRT-PCR检测发现trr的敲除阻断20E对Br-C的转录激活(图2: B)，与在野生型Kc细胞中添加H3K4甲基化抑制剂MTA的结果(图2: C)一致；Western blotting显示，trr的敲除明显降低细胞中H3K4三甲基化水平(图2: D和E)。结果表明，该敲除系统可以有效地对靶基因进行突变，用于后续在黑腹果蝇细胞中对组蛋白甲基转移酶的丧失功能鉴定。

图1 pAc-sgRNA-Cas9载体示意图和靶基因sgRNA构建策略(改自Bassett and Liu, 2014)

1.4 细胞转染

根据去内毒素质粒抽提试剂盒说明书抽提1.3节构建的质粒载体。黑腹果蝇Kc细胞提前24 h铺板，当细胞处于对数生长期并且铺满培养皿的80%～90%时，根据转染试剂说明书进行相应质粒转染Kc细胞。

1.5 编码组蛋白甲基转移酶的基因突变验证

为了筛选和检测参与20E信号传导的组蛋白甲基转移酶，以20E应答DNA元件EcRE驱动的荧光素酶活性作为筛选标志，分别将pAc-gfp/trr/Mes-4/ash1/Su(var)3-9/egg-sgRNA-Cas9敲除质粒与PGL3-4×EcRE和PGL4-Rluc内参载体共转染黑腹果蝇Kc细胞，44 h后添加20E(2 μmol/L)处理4 h，添加0.1%(体积比例)的DMSO作为对照，DMOS和20E处理各3个重复，参照Dual-Luciferase Report Assay System试剂盒说明书测定EcRE的荧光素酶活性，以F-luc(荧光素酶活性)/R-luc(海肾素酶活性)的比值作为相对荧光素酶活性。

表1 引物信息

1.6 qRT-PCR检测Br-C的转录水平

为了检测pAc-gfp/trr/Mes-4/ash1/Su(var)3-9/egg-sgRNA-Cas9敲除质粒载体对靶基因突变的有效性，我们选择已经报道的甲基转移酶Trr通过H3K4三甲基化修饰促进20E诱导初级应答基因Br-C的转录表达作为阳性对照，对该敲除系统进行验证。1.4节黑腹果蝇Kc细胞转染pAc-gfp/trr-sgRNA-Cas9敲除质粒44 h后，添加20E(2 μmol/L)处理gfp和trr敲除的Kc细胞4 h，添加DMSO作为对照，DMSO和20E处理各3个重复；未转染pAc-gfp/trr-sgRNA-Cas9敲除质粒的野生型黑腹果蝇Kc细胞添加H3K4甲基化酶抑制剂MTA(1 mmol/L)或/和20E(2 μmol/L)处理12 h，0.1%(体积比例)的DMSO作为对照，DMSO, MTA或/和20E处理各3个重复；随后收集相应表达质粒和药物处理后的细胞样品。总RNA提取、反转录形成cDNA第1链、qRT-PCR反应体系和条件参已报道的方法(龙诗慧等, 2019)。以果蝇rp49作为内参基因，计算目的基因的相对表达量。qRT-PCR引物如表1所示。

1.7 Western blot检测组蛋白甲基化水平

RIPA蛋白裂解液(碧云天, 上海)裂解1.4节转染pAc-gfp/trr/Mes-4-sgRNA-Cas9敲除质粒48 h后的黑腹果蝇Kc细胞样品，每个质粒转染3个重复，抽提细胞总蛋白，BCA蛋白浓度检测试剂盒(碧云天, 上海)测定蛋白浓度，Trr可以修饰H3K4三甲基化和Mes-4可以修饰H3K36单/二甲基化(表2)，利用H3K4三甲基化抗体(ABclonal, 武汉)检测敲除trr后Kc细胞中的H3K4三甲基化水平，利用H3K36单/二甲基化抗体(ABclonal, 武汉)检测敲除Mes-4后Kc细胞中的H3K36单/二甲基化水平，从而检测trr和Mes敲除的有效性。利用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值进行定量分析。

笔者随机选取了11所博士授予单位，对其研究生院学位管理部门进行了调查，调查方式为电话或网络通讯工具联系，调查内容主要为来华留学生博士论文撰写区别于本国学生的特别规定。

1.8 双荧光素酶检测EcRE活性

1.4节pAc-gfp/trr/Mes-4/ash1/Su(var)3-9/egg-sgRNA-Cas9敲除质粒分别转染黑腹果蝇Kc细胞48 h后收集细胞，参照说明书抽提细胞基因组，在上述敲除基因的sgRNA序列上下游区域设计检测引物(表1)，扩增长度约为500 bp，利用TaqTM酶进行PCR扩增，PCR反应体系(50 μL): TaKaRa TaqTM酶(5 U/μL)0.5 μL, 10×PCR Buffer 5 μL, dNTPs(各2.5 mmol/L)4 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, 基因组模板1 μL, 灭菌水37.5 μL。PCR反应条件: 95℃预变性2 min; 98℃变性10 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 30个循环; 72℃延伸10 min。扩增后的DNA片段利用pMDTM18-T试剂盒进行TA克隆并送广州擎科公司测序(Li Ketal., 2016)，检测靶基因突变位点。

1.9 数据分析

利用2-ΔΔCT法计算qRT-PCR中基因的相对表达量；利用平均值±标准差计算3组重复的误差；利用单因素方差(one-way ANOVA)结合Duncan氏多重比较分析多组数据间的显著性差异；利用t检验计算两组数据之间的显著性差异。

2 结果

2.1 果蝇组蛋白甲基转移酶及其修饰位点

将带有敲除基因靶标sgRNA序列的pAc-gfp/Mes-4/ash1/Su(var)3-9/egg-sgRNA-Cas9质粒转染黑腹果蝇Kc细胞48 h后，TA克隆测序结果显示，4个组蛋白甲基转移酶基因的PAM区附近均有碱基突变或缺失(图3: A-D)。Western blotting显示，Mes-4敲除后显著减少H3K36的单/二甲基化水平(图3: E, F)；随后，敲除组蛋白甲基转移酶基因并添加20E处理的细胞双荧光素酶活性显示，除修饰H3K4甲基化的trr敲除之外，Mes-4敲除也显著降低20E诱导的EcRE荧光素酶活性，ash1敲除没有影响；在修饰H3K9甲基化的甲基转移酶中，egg敲除降低20E诱导的EcRE荧光素酶活性，而Su(var)3-9敲除没有影响(图3: G)。

表2 果蝇组蛋白甲基转移酶及其修饰位点

2.2 黑腹果蝇Kc细胞中敲除trr阻遏20E对Br-C的转录诱导

5）在整体架构方面。教育不单单是学校、教育学部所应该关心的事情，更需要社会各个阶层、各相关机构共同努力奋战，在共同体系、目标下形成社会合力。针对一些创新课程，要启发到什么程度，是以必修课还是选修课的方式呈现，都需要比较详细的规定，建立具体的标准。

图2 黑腹果蝇Kc细胞中trr敲除后对20E诱导的Br-C转录水平和H4K3三甲基化水平的影响

2.3 黑腹果蝇Kc细胞中敲除组蛋白甲基化酶基因对20E诱导EcRE活性的影响

通过Flybase网站查询并总结所有果蝇组蛋白甲基转移酶及其修饰位点(表2)，结果显示，果蝇组蛋白在H3的4号位、9号位、27号位、36号位和79号位，以及H4的20号位赖氨酸残基均存在甲基化修饰，其中以H3上的4号位、9号位和36号位为主。H3和H4上精氨酸的甲基化修饰较少，只发生在H3的17号位(Art4)和H4的3号位(Art1)上。在所有组蛋白甲基转移酶中，Trr, set1, G9a和Su(var)4-20不但修饰H3上赖氨酸的单甲基化，还可以进行二/三甲基化修饰。此外，ash1和E(z)可以对H3多个位点上的赖氨酸残基进行甲基化修饰。

两组比较，学生对OSCE模式满意度较高，认为OSCE模式更符合教学大纲，在评分标准、难易程度、时间安排均比传统考核方式更合理，差异具有统计学意义（P＜0.05）（见表2）。

图3 组蛋白甲基转移酶突变检测和20E诱导的EcRE双荧光素酶活性测定

3 讨论

本研究利用牛津大学Liu实验室构建的pAc-sgRNA-Cas9敲除载体骨架，在使用时仅将组蛋白甲基转移酶的靶向sgRNA序列插入两个BspQI酶切位点中即可获得目的基因的敲除载体，而且突变序列的测序鉴定和相应组蛋白甲基化修饰抗体的Western blotting结果均验证了目的基因可以被有效地敲除和突变(图2: A, D和E; 图3: A-F)，该系统便于在果蝇细胞中研究基因的丧失性功能。同时，该实验室提供果蝇全基因靶标序列库，可以应用于特定信号传导、宿主和病原菌互作、离子运输等研究，通过结合药物进行大规模筛选获得靶标基因(Bassett and Liu, 2014; Viswanathaetal., 2018; 2019)。此外，后续可以基于该载体骨架进行改造，将Ac5和dU6-2启动子替换成其他昆虫的特异启动子用以表达Cas9蛋白和靶基因sgRNA序列，应用于不同昆虫细胞系的基因敲除和筛选研究。

王建国《扎实推进习近平新时代中国特色社会主义思想“三进”的思考》指出，“扎实推进习近平新思想‘三进’是高校坚持社会主义办学方向的根本保证；是高校培养担当民族复兴大任时代新人的时代需要；是促进高等教育内涵发展的必然要求。”[1]吴爱萍《推进习近平新时代中国特色社会主义思想“三进”的思考》指出，推进习近平新思想“三进”是用马克思主义中国化最新理论成果武装大学生头脑的重大举措；是加强和改进高校思想政治理论课教育教学的迫切需要；是助力大学生成长成才，培养有理想、有本领、有担当新时代青年的必然要求。

组蛋白甲基化修饰参与调控基因的转录表达，通过改变染色体构象，暴露或者隐藏靶基因的DNA调控元件，达到激活或者抑制靶基因转录表达的功能(Yunetal., 2011)。EcRE是20E-EcR-USP复合物的DNA结合元件，已被广泛应用于20E信号级联系统的研究(Guoetal., 2012)。20E诱导初级应答基因的转录表达不但有组蛋白甲基化修饰参与调控，还有组蛋白乙酰化等修饰(李康等, 2011)。本研究对组蛋白甲基转移酶进行筛选，发现除了已经报道的Trr修饰的H3K4三甲基化正调控20E对Br-C的转录调控(Sedkovetal., 2003)(图2: B和C)，同时检测到Mes-4和egg通过影响EcRE的活性参与对20E信号的调控(图3)。虽然双荧光素酶的结果显示敲除Mes-4和egg均降低EcRE的活性(图3: G)，但H3K9发生甲基化一般是抑制基因的转录表达，推测egg对EcRE活性的影响是间接的；Mes-4修饰H3K36发生甲基化一般是激活基因表达，与20E通过应答元件EcRE促进靶基因的转录表达相吻合，但Mes-4介导的二甲基化还是三甲基化调控EcRE的活性需要进一步解析。

修饰H3K4甲基化的Trr蛋白通过N端的核受体互作序列LXXLL与20E受体EcR和USP结合，促进Br-C的转录激活(Sedkovetal., 2003)；修饰H3K36甲基化的组蛋白甲基转移酶含有保守的核受体结合结构域(suppressor of variegation 3-9 and enhancer of zeste and trithorax domains, SET domains)(Strahletal., 2002; Jeongetal., 2018)，推测Mes-4通过该SET结构域与20E受体结合并促进20E诱导的EcRE活性，从而激活下游靶标基因的转录表达，具体调控的靶标基因和分子机制需要深入解析。

本研究采用牛津大学Liu实验室构建的pAc-sgRNA-Cas9敲除骨架载体和目的基因靶标序列的构建方法，利用该敲除系统在黑腹果蝇细胞中筛选和检测参与调控20E信号传导的组蛋白甲基转移酶，为今后利用细胞敲除系统探究组蛋白修饰在信号传导中的分子调控机理奠定工作基础。