辣木籽对酒精和四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用

张 蕾 ， 王璐瑶 ， 秦心宁 ， 郝婧玮 ， 李金旭 ， 陈 研 ， 肖婷婷 ， 吴禹歧

(牡丹江师范学院生命科学与技术学院 ， 黑龙江 牡丹江 157011)

辣木(Moringa) 为多年生的热带落叶乔木，产自印度，因为其根具有辛辣味而得此名。辣木的根、茎、叶、花、种子都含有丰富的药用和营养成分，是优质的保健食品原料[1-2]。辣木种子部分叫作辣木籽，研究表明，辣木籽具有降血糖、抗肿瘤、抗菌、清除自由基等功能[3-8]，但是对于其在肝脏损伤方面的研究还未有报道。本试验利用酒精和四氯化碳(CCl4)诱导小鼠建立肝脏损伤模型，研究辣木籽对模型小鼠肝损伤的影响，为探索辣木籽在临床上治疗肝损伤方面疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)，由黑龙江省齐齐哈尔市查阳医院进行检测；乙醇、亚丙醇、CCl4，均购自北京化工厂；红星二锅头(52°)，购自北京红星股份有限公司；肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒(美国 R & D公司)。

1.2 肝损伤小鼠模型的建立 随机选取90只雄性、健康的昆明小鼠，正常适应性饲养3 d后，分为正常组(作为对照)、酒精性肝损伤组(包括模型组、低剂量组、高剂量组和维生素E组)、CCl4肝损伤组(包括模型组、低剂量组、高剂量组和联苯双酯组)，每组10只，常规饲养。

酒精性肝脏损伤模型的建立：将小鼠随机分笼，分为模型组、低剂量组[灌胃给药辣木籽100 mg/(kg·bw)]、高剂量组[灌胃给药辣木籽200 mg/(kg·bw )]、阳性给药组[维生素E 组，灌胃维生素E 80 mg/(kg·bw)]，每组10只，连续灌胃给药20 d，模型组灌胃等量的生理盐水，在最后1次灌胃给药2 h后，酒精性肝损伤各组均一次性给予灌胃56°红星二锅头15 mL/(kg·bw)。小鼠在末次灌胃给药后禁食不禁水。

CCl4急性肝损伤小鼠模型的建立：将小鼠随机分笼，分为模型组、低剂量组[灌胃给药辣木籽100 mg/(kg·bw)]、 高剂量组[灌胃给药辣木籽200 mg/(kg·bw )]、阳性给药组[联苯双酯组，灌胃给药联苯双酯组100 mg/(kg·bw)]，每组10只，连续灌胃给药20 d，模型组灌胃等量的生理盐水，最后1次 灌胃给药2 h后，给小鼠注射10 mL/(kg·bw)的 0.1%CCl4花生油溶液。小鼠在末次给药后禁食不禁水。

1.3 血清指标检测 灌胃给药20 d后采取眼眶取血的方法，血样静置30 min后，4 000 r/min离心10 min， 取血清并采用试剂盒法检测AST、ALT、ALP和TNF-α。

1.4 肝组织形态学观察 小鼠处死后，立即取肝组织，经固定液固定后，通过H.E.染色观察各组小鼠肝脏组织形态学变化。

1.5 统计学分析 数据表示为平均值±标准差。使用GraphPad Prism 5和SPSS 13.0软件来进行统计学分析，P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 辣木籽对酒精诱导小鼠急性肝损伤的影响

2.1.1 辣木籽对酒精诱导小鼠急性肝损伤肝指数的影响 结果见图1。正常组小鼠每日饮水量正常，尿量正常，体重持续增加，皮肤光亮，活动灵活。模型组小鼠状态较差，皮毛干燥，精神萎靡不振。和模型组相比，辣木籽高剂量组小鼠状态明显改善。与正常组小鼠相比，模型组小鼠的肝脏指数显著增加(P<0.01)。与模型组小鼠相比较，辣木籽组和维生素E组小鼠的肝脏指数有明显的降低(P<0.01)。 这些结果说明辣木籽对酒精引起的肝肿胀现象具有一定的缓解作用。

图1 辣木籽对酒精诱导小鼠急性肝损伤肝脏指数的影响Fig.1 Effects of Moringa seeds on liver index in mice with alcohol-induced acute liver injury与正常组比较， **：P<0.01； 与模型组比较， ▲：P<0.05， ▲▲：P<0.01； 下图同Compare to normal group， **：P<0.01. Compare to model group，▲：P<0.05， ▲▲：P<0.01.The same as below

2.1.2 辣木籽对酒精性肝损伤小鼠血清中AST、ALT和ALP水平的影响 结果见表1。与正常组小鼠比较，模型组小鼠血清中AST、ALT和ALP的水平明显升高(P<0.01)，分别达到了(150.85±1.25)U/L、(165.35±3.21)U/L和(126.25±3.37)U/L。辣木籽低剂量组小鼠血清中AST、ALT和ALP的含量分别为(102.20±1.83)U/L、(96.63±1.73)U/L和(96.63±1.73)U/L，与模型组小鼠相比，具有显著性(P<0.05)；辣木籽高剂量组小鼠血清中AST、ALT和ALP的含量分别(60.50±3.00)U/L、(73.20±2.40)U/L和(52.30±1.50)U/L，与模型组小鼠相比显著降低(P<0.01)，维生素E组和模型组相比下降也很明显(P<0.01)，甚至和正常组相差不多。随着辣木籽给药量的提高，小鼠血清中AST、ALT和ALP水平明显升高，且具有剂量依赖性。

表1 辣木籽对酒精诱导小鼠急性肝损伤血液指数的影响Table 1 Effects of Moringa seeds on blood index in mice with alcohol-induced acute liver injury

2.1.3 辣木籽对酒精性肝损伤小鼠血清中TNF-α的影响 结果见图2。TNF-α是在体内肿瘤组织中杀伤某些肿瘤细胞或引起血液坏死的因子。与正常小鼠相比，模型组小鼠的TNF-α水平显著增加 (P<0.01)。与模型组小鼠相比，辣木籽给药组和维生素E组小鼠TNF-α水平均有不同程度的下降，其中高剂量组和维生素E组下降较明显(P<0.01)。这些结果说明了辣木籽可以改善肝损伤时的炎症程度。

图2 酒精性急性肝损伤小鼠血清中肿瘤坏死因子-α含量Fig.2 The TNF-α content in mice with alcohol-induced acute liver injury

2.1.4 辣木籽对酒精性肝损伤小鼠肝组织形态的影响 H.E.染色后，显微镜观察发现正常组小鼠体内肝细胞形态饱满，细胞排列整齐，肝索中中央静脉清晰可见。模型组小鼠肝细胞排列紊乱，细胞出现明显肿胀现象，炎性细胞浸润现象很明显。和模型组相比，辣木籽低剂量组和维生素E组小鼠肝细胞损坏程度有所改善，但肝小叶结构仍然混乱；辣木籽高剂量组和维生素E组肝细胞炎性细胞浸润现象明显改善，肝细胞损伤程度较轻，肝细胞排列较整齐(中插彩版图3)。

图3 酒精诱导急性肝损伤小鼠肝组织形态 (40×)Fig.3 Pathological changes of liver tissue in mice with alcohol-induced acute liver injury (40×)A：正常组； B：模型组； C：低剂量组； D：高剂量组； E：维生素E组A：Normal group; B：Model group; C：Low-dose group; D：High-dose group; E：Vitamin E group

2.2 辣木籽对CCl4诱导小鼠急性肝损伤的影响

2.2.1 辣木籽对CCl4诱导小鼠急性肝损伤肝脏指数的影响 正常组小鼠每日饮水量正常，尿量正常，体重持续增加，皮肤光亮，活动灵活，相比较来看模型组小鼠状态较差，皮毛干燥，精神萎靡不振；和模型组相比，辣木籽高剂量组小鼠状态明显改善。如图4所示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠的肝脏指数显著增加(P<0.01)，这表明CCl4引起小鼠肝脏显著增加。与模型组相比，辣木籽组和联苯给药组小鼠的肝脏指数显著降低，这些结果说明辣木籽对 CCl4引起的肝肿胀现象具有一定的缓解作用。

图4 辣木籽对CCl4诱导小鼠急性肝损伤肝脏指数的影响Fig.4 Effect of Moringa seeds on liver index in mice with CCl4-induced acute liver injury

2.2.2 辣木籽对小鼠血清中AST、ALT和ALP水平的影响 (见表2)。与正常组小鼠比较，模型组小鼠血清中AST、ALT和ALP的活性明显升高(P<0.01)，分别达到了(138.30±3.60)U/L、(147.90±2.93)U/L和(117.60±0.98)U/L。辣木籽低剂量组小鼠血清中AST、ALT和ALP的含量分别为(92.10±0.78)U/L、(116.50±1.73)U/L和(89.60±3.73)U/L，与模型组小鼠相比差异显著(P<0.5)；辣木籽高剂量组小鼠血清中AST、ALT和ALP的含量分别(114.35±2.31)U/L、(126.34±3.27)U/L和(92.83 ±2.51)U/L，与模型组小鼠相比显著降低(P<0.01)，联苯双酯组和模型组相比下降也很明显(P<0.01)，甚至和正常组相比差不多。随着辣木籽给药量的提高，小鼠血清中AST、ALT和ALP水平明显升高，具有剂量依赖性。

表2 辣木籽对四氯化碳诱导急性肝损伤小鼠血液指数的影响Table 2 Effects of Moringa seeds on blood index in mice with CCl4- induced acute liver injury

2.2.3 辣木籽对CCl4肝损伤小鼠血清中TNF-α的影响 肿瘤坏死因子(TNF-α)是在体内肿瘤组织中杀伤某些肿瘤细胞或引起血液坏死的因子。与正常小鼠相比，模型组小鼠的TNF-α水平显著增加 (P<0.01)。与模型组小鼠相比，辣木籽组和联苯双酯组小鼠TNF-α水平均有不同程度的下降，其中高剂量组和联苯双酯组下降较明显(P<0.01) (图5)。这些结果说明了辣木籽可以改善肝损伤时的炎症程度。

图5 CCl4急性肝损伤小鼠血清肿瘤坏死因子-αFig.5 The TNF-α content in mice with CCl4-induced acute liver injury

2.2.4 辣木籽对CCl4肝损伤小鼠肝组织形态的影响 H.E.染色发现，正常组小鼠体内肝细胞排列整齐，细胞核和肝索中中央静脉清晰可见。模型组小鼠肝细胞排列紊乱，细胞出现明显肿胀现象，炎性细胞浸润现象明显。和模型组相比，辣木籽低、高剂量组和联苯双酯组小鼠肝细胞损坏程度有所改善，肝细胞排列较整齐(中插彩版图6)。

图6 CCl4急性肝损伤小鼠肝组织病理变化 (40×)Fig.6 Pathological changes of liver tissue in mice with CCl4-induced acute liver injury (40×)A：正常组； B：模型组； C：低剂量组； D：高剂量组； E：维生素E组A：Normal group; B：Model group; C：Low-dose group; D：High-dose group; E：Vitamin E group

3 讨论

肝损伤是一种常见临床疾病，严重危害人类的身体健康，它是指肝脏受到外部因素的侵袭而受到的损伤，可分为病理性的肝损伤和化学性的肝损伤。酒精性肝脏损伤(ALD)是指大量或长期饮用含酒精饮品引起的肝脏疾病，是肝硬化疾病的常见病因。近年来，酒精性肝损伤的发生率明显增加，引起了医学界和社会的广泛关注。急性酒精性的肝损伤的机制是乙醇被人体吸收，在乙醇脱氢酶和脱氢醋酸乙醛的催化下，产生活性的氧自由基，导致由肝细胞损伤引起的肝脏细胞膜的脂质过氧化作用[9]，乙醇进一步氧化成乙酸，最后进入线粒体内三羧酸循环(Krebs)循环被完全氧化成CO2和H2O，释放能量[10]。该过程使辅酶连续转化为还原型辅酶，当其比例变化，会抑制Krebs循环，脂肪的氧化减弱,使肝内的脂肪酸增多[11]，酒精性肝损伤可以使血清内转氨酶升高，使肝细胞变性、水肿、坏死[12]等。

CCl4肝损伤的机制与CCl4自身及其自由基的代谢产物有关。当CCl4进入体内后，其最终代谢成氧自由基自由基团-CCl3O2和2-三氯甲基(CCl3)。这个过程需消耗大量的抗氧化剂，可导致机体处于氧化应激状态。氧化应激是CCl4诱导肝损伤的重要环节[13]。血清ALT、AST和ALP水平的增加归因于肝脏结构受损[14]。通常可以通过分析血清ALT、AST和ALP水平来确定细胞死亡。在本试验中与模型组的小鼠相比，100 mg/(kg·bw)和200 mg/(kg·bw)辣木籽组小鼠血清中的ALT、ALP、AST含量明显降低，且呈剂量依赖性。

肿瘤坏死因子是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的单核细胞因子，在肝脏损伤的过程中起重要作用[15-16]。研究表明，肿瘤坏死因子是由核因子κB(NF-κB)监管,并增加其释放促进NF-κB的磷酸化，而使NF-κB激活，通过持续的复杂循环来调节炎症反应[17]。同时，肿瘤坏死因子作为肝脏损伤的第一介质，即使有少量的肿瘤坏死因子存在，也会发生组织的损伤[18-19]。本试验结果显示，模型组小鼠的TNF-α水平显著增加，辣木籽组和阳性给药组小鼠的TNF-α水平下降较明显，说明辣木籽对CCl4和酒精所导致小鼠急性肝损伤有改善作用，其作用机制可能和减轻炎症因子有关。

本试验为辣木籽在临床上治疗肝损伤的应用提供了理论依据，证实辣木籽对CCl4和酒精所致的急性肝损伤有缓解作用，但其相关的副作用也需进一步探讨研究。