1例结石患犬尿液中犬种布鲁氏菌的分离与鉴定

黄 薇 ， 蒋 卉 ， 冯 宇 ， 肖 盟 ， 缴 莹 ， 刘 洋 ， 季玲西 , 吕艳丽，4

(1.中国农业大学教学动物医院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.中国兽医药品监察所 国家/OIE布鲁氏菌病参考实验室 ， 北京 大兴 102600 ； 3.中国医学科学院北京协和医院检验科 侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室 ， 北京 东城 100730 ； 4.中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193)

犬布鲁氏菌病(以下简称犬布病)是由布鲁氏菌感染引起的人兽共患病。引起犬布病的细菌主要是犬种布鲁氏菌(B.canis)，有时羊种(B.melitensis)、牛种(B.abortus)和猪种(B.suis)布鲁氏菌也可导致犬布病。除了不孕症、母犬流产、公犬睾丸炎和附睾炎等生殖系统疾病外，犬种布鲁氏菌还可引起犬的无症状感染和淋巴结病、脾脏肿大及葡萄膜炎、椎间盘炎等多种临床病症。由于犬种布鲁氏菌对人的致病力较牛种、羊种和猪种布鲁氏菌弱，世界卫生组织(WHO)和世界动物卫生组织(OIE)都没有将犬种布鲁氏菌列入法定报告的人兽共患病病种，但国内外关于犬种布鲁氏菌感染人的情况时有报道[1-3]，且人类实际感染数量可能远远高于确诊病例的数量[4-5]。文献报道犬可以通过尿液向外界排菌，但通过尿液向外界排菌所造成危害的严重程度鲜有人关注。本文通过对1例膀胱结石患犬尿液中的犬种布鲁氏菌的分离鉴定过程进行描述，以期引起宠物诊疗人员和饲养、繁殖相关人员对犬种布鲁氏菌病的高度重视，为防控人间犬种布鲁氏菌病的发生提供科学依据。

1 患犬基本信息

博美犬，7岁，雄性，体重4.02 kg，因尿闭在外院导尿失败而转至中国农业大学教学动物医院。在外院就诊时经超声引导穿刺排放尿液2次。体格检查发现，患犬左侧皮下隐睾，其他未见明显异常。泌尿系统B超检查结果提示，患犬膀胱内和前列腺段尿道结石。血常规检查发现，白细胞总数升高至19.06×109/L(正常范围：5.05×109～16.76×109/L)，叶状中性粒细胞升高至14.29×109/L(正常范围：2.95×109～11.64×109/L)，伴杆状中性粒细胞增高至1.14×109/L(正常范围：0～0.3×109/L)，提示急性炎症。血清生化检查未见明显异常。尿液检查发现，患犬尿液pH为7.5，轻度偏碱性。对患犬行膀胱切开手术取出结石并同时实施了去势手术。对术中取出的结石采用布鲁克结石红外分析仪(布鲁克北京科技有限公司)进行分析，结果显示结石成分为95%鸟粪石和5%磷酸钙。

2 细菌分离培养与鉴定

分别将术中采集的尿液和膀胱黏膜，术后第14天和第60天膀胱穿刺采集的尿液样本及术后第60天采集的血液样本进行了细菌分离培养与鉴定。

2.1 细菌分离培养 将术中采集的尿液和膀胱黏膜，分别接种到血琼脂平板和麦康凯琼脂平板上于37 ℃条件下培养。接种后24 h，2种培养基上均未见细菌生长；继续培养至48 h，可见接种尿液的血琼脂培养基上有针尖大细菌菌落生长；继续培养至72 h，可见血琼脂平板上生长出直径约0.5 mm、半透明、圆形隆起、表面湿润、边缘规则的菌落，数量为5×102CFU/mL。取单个菌落进行革兰染色镜检，镜下可见菌体呈革兰染色阴性、短杆状、球形或球杆状细菌(中插彩版图1)。膀胱黏膜37 ℃需氧培养72 h，未见细菌生长。

图1 犬种布鲁氏菌镜下形态 (革兰染色，1 000×)

2.2 细菌飞行质谱鉴定和16S rDNA PCR扩增与序列分析 将分离获得的菌株经基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS，飞行质谱)技术分析，与绵羊附睾种布鲁氏菌(Brucellaovis)最为相似，分值为9.159。将分离菌株进行16S rDNA PCR扩增和序列分析，布鲁氏菌核苷酸序列同源性最高为99.7%。

2.3 布鲁氏菌Bruce-Ladder PCR鉴定 参照GB/T 18648-2018 《动物布鲁氏菌病诊断技术》[6]合成8对PCR序列引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]，对分离菌株进行Bruce-Ladder PCR分子鉴定，反应体系：10× PCR缓冲液2.5 μL，dNTPs (2.0 mmol/L)5.0 μL，Mg2+(50 mmol/L) 1.5 μL，8对 引物混合液(12.5 μmol /L)7.6 μL，TaqDNA聚合酶 0.3 μL，DNA模板(0.1 μg/μL)1 μL，超纯水7.1 μL，共25 μL。扩增参数：95 ℃预变性7 min；95 ℃变性35 s，64 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，共计25个循环；最后72 ℃延伸6 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像分析，结果显示，分离菌株为犬种布鲁氏菌(图2)。

图2 分离菌株的Bruce-Ladder PCR扩增M：DL-5 000 DNA marker； 1：患犬分离菌株； -：阴性对照； +：犬种布鲁氏菌标准株RM6/6

2.4 分别于术后第14天和第60天再次穿刺采集尿液进行细菌分离鉴定及菌落计数，分离获得的细菌仍为犬种布鲁氏菌，菌落计数分别为4×103CFU/mL和1×105CFU/mL。术后第60天同时采集了患犬抗凝血进行细菌培养，37 ℃培养72 h，未见细菌生长。

2.5 布鲁氏菌血清学检测 初次分离的细菌经MALDI-TOF-MS技术分析初步鉴定为绵羊附睾种布鲁氏菌后，采集患犬血清进行布鲁氏菌虎红平板凝集试验(抗原由中国兽医药品监察所国家动物布鲁氏菌病参考实验室制备)，结果显示，犬种布鲁氏菌凝集试验阳性(+)，光滑型布鲁氏菌凝集反应阴性(-)。采用胶体金凝集试纸条对血清样本进行验证，结果与虎红平板凝集试验一致，即犬种布鲁氏菌阳性(+)(韩国安捷动物诊断试剂有限公司)，光滑型布鲁氏菌阴性(-)(上海快灵生物科技有限公司)。

3 讨论

患犬因膀胱结石引起的尿闭前来就诊，在常规导尿失败后对患犬实施了膀胱切开取石手术，并针对患犬的隐睾问题，进行了公犬去势术。手术同时，按照中国农业大学教学动物医院常规流程对患犬尿液进行了细菌培养，分离菌株经系列鉴定后确定为犬种布鲁氏菌。从结石患犬的尿液中分离出犬种布鲁氏菌尚未见报道。本试验同时发现，术后患犬尿液中的布鲁氏菌含量呈上升趋势，该生长趋势有待于进一步探讨，尿液排放至环境所导致的环境污染以及所造成的危害应引起高度重视。

3.1 犬种布鲁氏菌的分离培养与鉴定 除了膀胱和尿道结石外，患犬术前未表现出睾丸炎、关节炎和椎间盘炎等犬种布鲁氏菌感染的常见临床症状。布鲁氏菌为营养要求苛刻的需氧菌，通常48 h内罕见形成菌落，一般需要培养5～10 d甚至20～30 d[7]。本分离菌株的生长速度较快，故初次分离出的细菌在进行鉴定之前并未考虑其为布鲁氏菌的可能性。随后的MALDI-TOF-MS技术分析结果提示，分离菌株与绵羊附睾种布鲁氏菌最为相似，获得该鉴定结果的原因为绵羊附睾布鲁氏菌与犬种布鲁氏菌同为粗糙型布鲁氏菌，有相似的脂多糖(LPS)结构，但该数据库中未包含犬种布鲁氏菌数据，因此该结果一方面为后续鉴定指明了方向，同时丰富了质谱数据库资料。同样，16S rDNA序列分析结果也未将犬种布鲁氏菌与其他种布鲁氏菌鉴别开来，因为16S rDNA 在布鲁氏菌的不同种间差异很小[8]。基于布鲁氏菌的人兽共患危害性，在获得质谱鉴定结果后，采集了患犬血清进行了血清学试验，分离菌株经中国兽医药品监察所国家布鲁氏菌参考实验室进行的Bruce-Ladder PCR鉴别诊断，最终确定为犬种布鲁氏菌。

3.2 膀胱结石与犬种布鲁氏菌的相关性 鸟粪石又叫磷酸铵镁结石，几乎95%的犬鸟粪石都是由脲酶阳性细菌感染引起的。产脲酶的细菌可将尿中的尿素水解成氨和二氧化碳，提高了尿液的pH，使铵离子可以形成磷酸铵镁晶体[9]。犬种布鲁氏菌是产脲酶细菌之一，该患犬尿液pH 7.5，并且穿刺获得的尿液中仅培养出了犬种布鲁氏菌。由此推测患犬膀胱中的鸟粪石形成与犬种布鲁氏菌感染密切相关。

3.3 犬种布鲁氏菌与公共卫生安全 在布鲁氏菌感染病例中，通常具有流产、睾丸炎、附睾炎症状的病犬容易引起人们的关注和高度重视，但无症状或症状不典型的带菌犬容易被人忽视。本病例先后3次从膀胱穿刺采集的尿液中分离出了犬种布鲁氏菌，且菌落计数数量呈递增趋势。这对于试图通过对患犬实施绝育和去势手术以降低犬种布鲁氏菌传播风险[7]的愿景是一种挑战。该分离结果源于布鲁氏菌间歇排毒所致还是疾病发展不同阶段所致，有待进一步研究。值得注意的是，排尿引起了犬种布鲁氏菌对环境的污染，这种危害的严重性将远远大于犬种布鲁氏菌感染生殖系统所致的风险，具有重要公共卫生意义，应引起宠物医生、犬舍、流浪犬收容所和宠物主人，尤其是公共卫生主管部门的高度重视。尽管犬种布鲁氏菌对人的致病力较弱，但作为一种人兽共患病，已有引起人类的败血症、心内膜炎[7]等疾病的报道。