种子细胞与生物支架在脊髓组织工程中的实验研究进展

漆国栋，江琼，伍亚民，漆伟

1.重庆市中医骨科医院骨科，重庆市 400010；2.重庆医科大学中医药防治代谢性疾病重庆市重点实验室，重庆市 400016；3.陆军军医大学大坪医院野战外科研究所，创伤烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆市400042

脊髓损伤是一种具有较高致残率的中枢神经系统疾病，严重影响患者身心健康，在全球范围内皆具流行性[1]。脊髓原发性损伤造成的微血管出血、组织缺血及神经元损伤与初始破坏性撞击有关，这种损伤是不可逆的[2]。继发性损伤在随后数分钟到数天内逐渐形成，会引起炎性因子大量释放[3]、微环境的各种级联放大反应[4]、氧化应激反应[5]等，这些都会最终导致神经细胞凋亡，从而阻止神经再生的可能。

组织工程技术在再生医学中有着广泛的应用，可以用来替代、恢复或增强组织功能[6]。在脊髓损伤领域，脊髓组织工程通过种子细胞与生物支架可以构建一个模拟天然脊髓外基质的微环境，能够促进特定的细胞-基质相互作用，诱导细胞行为，促进宿主脊髓再生[7]。近期有研究对脊髓组织工程的临床应用安全性和可行性进行评估，这些研究都通过磁共振结果、神经电生理学和神经功能评分等方法展示了患者功能恢复证据[8-9]。由于都是小样本量临床研究，缺乏权威证据证明其临床可推广性，脊髓组织工程目前仍停留在实验研究阶段以解决不断存在的问题。本文以脊髓组织工程中的种子细胞和生物支架存在问题为切入点，对近期实验研究进展进行综述。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究采用主题检索方法，检索中国知网、万方、PubMed、Web of Science 建库至2021 年3 月公开发表的中英文文献。中文检索策略：脊髓损伤AND(种子细胞OR 生物支架OR 组织工程)。英文检索策略：spinal cord injury AND (seed cell OR biological scaffold OR tissue engineering)。同时查询所有纳入文献的参考文献，避免遗漏。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：①涉及种子细胞在脊髓损伤中的选择和应用；②讨论生物支架在脊髓损伤中的传统用法和改良；③涵盖各类种子细胞和生物支架复合模式的脊髓组织工程研究；④同领域选择近5 年在权威杂志上发表的文章；⑤具有原创性，且文章结果可靠。

排除标准：①未出版的论文(包括学位论文、会议论文等)；②不能获取全文；③与主题无关。

1.3 文献筛选

由熟悉脊髓损伤的神经再生治疗并了解脊髓组织工程的研究人员进行文献筛选和分析，初检得到文献2386 篇，筛选后纳入85 篇，其中英文82 篇，中文3篇。筛选流程图见图1。

图1 文献筛选流程图

2 结果

共纳入文献85 篇，主要来自美国、中国和英国等，期刊主要来源于Biomaterials、Mater Sci Eng C Mater Biol Appl和ACS Appl Mater Interfaces等。文 献[1-9]阐述了脊髓组织工程应用于脊髓损伤后神经再生的可行性与对抗病理过程所需面临的挑战；文献[10-25]介绍了脊髓组织工程中种子细胞的选择；文献[26-43]探讨了种子细胞存在的问题与近期解决方案；文献[44-51]介绍了脊髓组织工程中生物支架的特点及传统选择；文献[52-63]探讨了生物支架存在的问题与近期解决方案；文献[64-85]探讨了种子细胞与生物支架复合构建脊髓组织工程的问题及近期不同复合模式尝试。

2.1 种子细胞的问题及进展

脊髓组织工程选用的种子细胞可以参照临床细胞疗法。Levi 等[10]评估了人神经干细胞移植治疗慢性脊髓损伤效果；最新一项纳入37个细胞试验的系统评价发现[11]，绝大多数临床研究使用的细胞种类是干细胞，其次是以嗅鞘细胞、施万细胞为代表的周围神经细胞。本文回顾列举一些代表性干细胞和周围神经细胞在治疗脊髓损伤时的作用机制(表1)[12-25]，发现种子细胞种类中干细胞选择多且作用机制广泛。因此本文首先探讨干细胞作为种子细胞的问题及进展。

表1 种子细胞中的干细胞和周围神经细胞列举

传统研究认为，干细胞作为种子细胞的问题可归纳为潜在的致癌性、免疫排斥反应和伦理道德。

致癌性方面，干细胞的DNA 修复活性、基因不稳定、缺乏自我限制等特性与癌细胞相似，不完全分化的神经细胞会增加形成畸胎瘤的可能性[26]。为了降低肿瘤的潜在风险，通过移植前的体外细胞处理，干细胞可以通过默认路径分化为神经祖细胞[27]。而最新的研究尝试对神经干细胞进行光遗传学刺激，通过低辐照度光刺激敷衍系统可降低其致癌性[28]。

免疫排斥方面，同种异体移植可能表达主要的组织相容性抗原导致免疫排斥反应。既往研究认为临床细胞移植应与地塞米松等免疫抑制剂联合应用[29]。而近年一些低免疫原性的细胞被认为可以加以利用。有学者通过可视化分析研究认为间充质干细胞的异种移植是可行的[30]，后续的机理研究揭示其低免疫原性的原因可能与在受体内可表达免疫细胞样特征有关[31]。

伦理道德方面，人类胚胎在道德上等同于成人，为科学研究创造人类胚胎是不可接受的。Yamanaka等[32]首次利用病毒载体将四种转录因子导入小鼠成纤维细胞获得诱导性多能干细胞，作为任意来源的万能细胞，可以不需要用人类胚胎的成体细胞制造。一项循证研究也证实，诱导多功能干细胞能移植后可有效改善脊髓损伤大鼠模型的运动功能[33]。近期已有临床研究通过伦理审核，将首次尝试诱导多功能干细胞干预亚急性脊髓损伤患者[34]。

此外，无论是干细胞还是周围神经细胞作为种子细胞，其最核心的问题是细胞移植后的低存活率和分化率，这也是近年来细胞实验研究最集中的热点，而相应的基因转染技术、多细胞共移植和移植前预处理成为实验研究进展。

首先，基因转染技术可以将特异性核酸导入细胞并维持其生物学功能，从多方面有利于细胞的生存和分化。Tang 等[35]通过基因转染的方法将脂肪干细胞过表达神经元素2(neurogenin2,Ngn2)，与单纯脂肪干细胞移植组相比，Ngn2 过表达组神经元分化率更高，能上调脑源性神经营养因子、血管内皮生长因子等营养因子，抑制胶质瘢痕形成。Shi 等[36]建立稳定的过表达转谷氨酰胺酶2型(transglutaminase type 2,TG2)基因的间充质干细胞系，结果表明可以促进更高的神经元分化率，并促进神经功能的恢复。过表达胰岛素样生长因子1 (insulin-like growth factor 1,IGF-1)基因的骨髓间充质干细胞移植到小鼠脊髓挫伤模型后，相较于野生型更能提升细胞存活率、免疫调节、髓鞘形成和功能改善[37]。

其次，多细胞共移植可以相互弥补细胞之间的缺陷。施万细胞移植由于无法迁移到脊髓远端，无法修复脊髓外受损区域，有研究试图将善于迁移的嗅鞘细胞与之联合，结果表明联合移植组在损伤区的分布范围更广，促进巨噬细胞表型从M(γ 干扰素)向M(白细胞介素4)转化，并提供较好的免疫环境和减少损伤部位的炎症浸润，调节炎症细胞因子和趋化因子的表达[38]。基于间充质干细胞可能会降低神经干细胞移植后成瘤性风险的观点，Sun 等[39]尝试人类脐带间充质干细胞和人类神经干细胞共移植治疗大鼠脊髓挫伤，结果表明共移植组无论是移植细胞存活率还是功能改善都显著高于单细胞移植组。脂肪干细胞具备良好的分泌体再生性，而嗅鞘细胞具备很好的迁移引导性，有研究发现将二者进行联合移植可以减少病变部位的炎症反应与星形胶质细胞增生[40]。

最后，一些移植前预处理方法也可以提高细胞的存活率和分化率。Zhilai 等[41]在移植人脐带间充质干细胞前先经过5%低氧浓度培养，发现该方法可以增加轴突保存，并使caspase-3+细胞和ED-1+巨噬细胞数量减少。Song等[42]观察依达拉奉联合神经干细胞移植对大鼠脊髓全横断损伤修复的影响，发现依达拉奉可促进损伤区神经干细胞的存活和分化，联合移植可提高大鼠脊髓损伤修复的效果。本研究团队研究表明[43]，中药单体黄芪总皂甙能促进体外培养神经干细胞向神经元方向分化，与激活Wnt信号通路，从而调控该通路下游促分化靶向蛋白Ngn1的表达。

2.2 生物支架的问题及进展

作为脊髓组织工程的生物支架，其基本要求可以概括为以下四点[44-45]。第一，具有良好的生物相容性和生物降解性。降解时间与神经再生的病理阶段有关，支架可以与周围组织结合，支持神经再生和成熟。第二，立体结构，高比表面积。它应该具有适当的机械性能，如强度、硬度、弹性和长度，这有利于表面材料的交换和细胞的黏附和生长。第三，足够的神经生长因子，以保证神经再生的营养。第四，原料来源广，生产方便。

本文回顾列举了一些传统生物支架在脊髓损伤中的实验研究(表2)[46-51]。通过这些研究可以发现生物支架的问题在于单一材料选择无法同时满足生物相容性、生物降解和力学性能等特点，而传统工艺也无法更好模拟内部结构精密的脊髓组织。因此，生物支架的进展在于材料和工艺的新选择。

表2 传统生物支架实验研究列举

材料选择方面，两种复合材料的支架逐渐成为新选择。胶原与丝素蛋白电纺制备的支架具有较好的物理性能，同时保持良好的生物相容性。丝素蛋白降解速度慢，能为细胞提供与生长速度相匹配的支持。胶原蛋白与丝素蛋白的结合，可以改善胶原蛋白在干燥状态下的物理性质，也可以提高薄膜的耐水性，降低热水溶解率[52]。Kwiecien 等[53]尝试将胶原蛋白与壳聚糖两种材料进行复合，除了常规桥接损伤部位外，还发现可以作为载体持续性释放搭载的生物分子制剂，从而发挥抑制炎症等作用。有研究设计可注射纳米纤维水凝胶复合材料以提供机械强度和孔隙率，发现该复合支架可在没有任何外源性因素或细胞的情况下，对损伤脊髓提供机械支持，并支持损伤组织中的促再生巨噬细胞极化、血管生成、轴突生长和神经发生[54]。人工材料可以改善低力学性能和高降解率，反之天然材料也可以改善人工材料的低生物相容性。为了解决肽纳米纤维支架力学性能差、降解率高的问题，研究人员提出聚丙交酯-乙交酯复合改性支架，结果表明新的肽支架增强了种子细胞的黏附、伸展和表型表达[55]。Ahi 等[56]采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为内层支架材料更好促进种子细胞生长，胶原蛋白作为外层支架材料更好促进生物分子制剂释放，这种聚乳酸-羟基乙酸共聚物/胶原蛋白双层支架可以更好促进神经轴突的生长。

在工艺选择方面，模拟脊髓组织内部致密结构的静电纺丝和3D 打印正逐渐兴起。静电纺丝是利用聚合物发射源和接地集电极之间的大电压梯度，从聚合物溶液或熔体中提取含有微米和纳米直径纤维支架的过程，往期综述性研究回顾了静电纺丝技术制备脊髓支架的优越性和实用性[57-58]。Yan等[59]利用静电纺丝技术和复合人工材料制备出一款新型的纳米纤维网，检测后发现该支架具备更优的亲水性，可以上调多巴胺和苯胺四聚体的含量，且具备良好的电活性。Cnops等[60]将静电纺丝技术进行改良，通过改变静电纺丝时间可以得到不同纤维密度的支架，结果表明具有高纤维密度以及纤维束之间大量的小间隙的支架对促进神经再生更加有利。3D 生物打印通过特制“生物墨水”，以计算机三维模型为“图纸”，实现快速原型打印，构建复杂的组织结构，最终制造出人造器官和生物医学产品，目前该技术在骨组织工程的基础研究已得到长足发展并已延伸到临床应用，充分体现了该技术在人体器官再生中的潜力[61]。脊髓组织作为3D 打印研究的热点之一，Koffler 等[62]使用微尺度连续投影打印方法可在1.6 s内打印出适合啮齿动物脊髓大小的三维仿生水凝胶支架，并可根据人类脊髓大小和损伤形状进行缩放；并且该支架可通过种植神经前体细胞形成突触并伸入损伤下方的宿主脊髓，以恢复突触传递并显著改善功能结局。Sun 等[63]将胶原/壳聚糖作为打印材料，发现3D 打印的支架对大鼠全横断脊髓模型具有显著的治疗作用，相较于传统冻干支架可显著促进神经功能恢复。

2.3 种子细胞-生物支架复合的问题及进展

脊髓组织工程的构建是指种子细胞与生物支架的复合，具体又可以分为体内复合和体外复合。体外复合是将细胞种植在具有三维结构的支架上，在培养基中共同培养，使细胞在三维支架中迁移和生长，最终形成细胞-支架复合体。体内复合就是将细胞-支架复合体整体移植入体内，然后在体内完成组织的形成和支架材料的降解。体外复合是前提，体内复合是延续。近年来如何选择有效的细胞-支架复合模式已成为脊髓组织工程实验研究的新热点[64]。

复合的核心问题在于不同种子细胞与生物支架的模式会带来不一样的效果，有些有益，有些无用，有些甚至有害。搭载生物分子的纤维蛋白支架种植胚胎干细胞，移植后导致细胞存活率降低和巨噬细胞浸润增加[65]。而在自组装肽纳米纤维支架种植灵长类神经干细胞进行体外培养并不会导致细胞分化率有显著差异[66]。在此，本文回顾并列举了一些有代表性的近期脊髓组织工程中种子细胞与生物支架复合模式[67-80]，主要包含前文提及的种子细胞种类与生物支架新选择，这或许能为接下来尝试不同种子细胞与生物支架复合模式提供研究方向(表3)。此外，生物制剂等其他因素的引入，也为复合模式提供了新的思路。由于使用了包裹生物制剂的支架，可以通过缓释生物制剂使种子细胞具有较高的细胞活性，具有良好的细胞分布和表型，并且在移植后期表现出很强的生物相容性[81]。Li 等[82]在单纯胶原支架上搭载西妥昔单抗，结果表明这套功能性支架可以促进支架上的神经元分化、成熟，髓鞘和突触的形成，并可以极大降低硫酸软骨素蛋白聚糖沉积在病变部位。基于紫杉醇能减少胶质瘢痕，加强内在轴突再生的观点，有研究制备了可以在体内长时间释放紫杉醇的胶原蛋白支架，在种植神经干细胞后移植到T8脊髓完全横断模型中，结果表明该模式提供了一个有益的神经干细胞分化为神经元的微环境，促进神经元再生和轴突延伸，最终改善运动诱发电位和下肢运动的恢复[83]。

表3 近期脊髓组织工程种子细胞-生物支架复合模式列举

3 小结

脊髓损伤康复临床路径包括急性期重建脊柱和神经减压外科治疗，以及亚急性和后期综合康复[84]。而脊髓组织工程有潜力彻底改变脊髓损伤治疗路径。脊髓组织工程首先通过手术挽救脊髓功能，接着通过支架上的种子细胞促进受损脊髓的再生和替代受损神经元样细胞，然后支架的桥接作用增强再髓鞘，最后在各种因素的协同作用下，整个机体得到最大程度的康复。本文简要阐述脊髓组织工程中的种子细胞与生物支架各自及复合时存在的问题及进展，而在实践研究中，研究者既可以单纯改良种子细胞或者生物支架，也可以共同改良。如Ji 等[85]对种子细胞与生物支架同时进行改良，首先通过基因转染技术将高表达脑源性神经营养因子和神经营养素3 的脂肪干细胞作为种子细胞，然后首次选用丝素蛋白/壳聚糖复合材料制备生物支架，最后以此作为新型复合模式移植到大鼠脊髓损伤模型中。总之，未来的实验研究可以尝试以解决种子细胞与生物支架问题作为基础，重点深入探索适宜的复合模式，从而为临床应用转化提供依据。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。