HPLC-DAD法同时测定舞阳贝母中9种核苷类成分的含量

李 珊，王晓燕，黄 霞，张红伟*，刘 菊，赵一擎，茹庆国

(1.河南省食品药品检验所，国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室，郑州 450018；2.郑州市中医院，郑州 450007)

贝母为百合科贝母属多种植物的鳞茎，是常用中药之一，始载于《神农本草经》：“味辛，平。主伤寒烦热；淋沥邪气；疝瘕；喉痹；乳难；金创风痉。”[1]。百合科(Liliaceae)贝母属(FritillariaL.)植物的多数种类可供药用，广泛分布于北欧、北美洲及亚洲温带地域。我国贝母属植物资源丰富，约有50个种类、19个变种，主要分布于浙江、四川、新疆、甘肃、湖北和安徽等省[2]。《中国药典》2015年版一部中收载了川贝母、浙贝母、平贝母、湖北贝母和伊贝母等药用贝母，全国各地用作贝母的原植物种类繁多，川贝母野生资源日渐枯竭，各地均有替代品[3]。现代药理研究表明，贝母具有抑菌[4]、镇咳[5-8]、平喘[9-12]和抗肿瘤[13-17]等作用。

舞阳贝母为百合科植物舞阳贝母FritillariawuyangensisZ.Y.Gao的干燥鳞茎或鳞叶，于1983年在河南省野生经济植物资源考察中被发现，现已收入《河南省中药材标准》，中药材名为“贝母”。舞阳贝母主要分布在河南省舞钢市、驻马店市、南阳市和信阳市等地，为河南省特有的药材资源，生于海拔230～700 m的山坡草丛或疏林草地，舞钢市为其分布中心，现已人工栽培，疗效确切，有较长的栽培和使用历史[18]。但是，舞阳贝母的基础研究相对薄弱，特别是对其化学成分的研究较少。贝母的水溶性活性成分主要为核苷类，现有研究多针对其核苷类成分进行含量测定[19-29]。核苷类物质是生物机体细胞维持生命活动的基本组成成分，具有多种生物活性[30]，可作为舞阳贝母的质量评价指标。本文建立能同时测定舞阳贝母中9种核苷类成分的高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)法，为舞阳贝母的进一步开发利用和质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1仪器 Agilent1260型高效液相色谱仪，Agilent DEAA311731型(二极管阵列检测器)，XPE205型万分之一电子天平(瑞士梅特勒托利多公司)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Mili-Q Advantage A 10型超纯水系统(美国Millipore公司)。

1.2试药 甲醇为色谱纯(德国默克股份两合公司)；超纯水，自制。舞阳贝母样品经河南省食品药品检验所雷留成主任药师鉴定为百合科植物舞阳贝母FritillariawuyangensisZ.Y.Gao的干燥鳞茎或鳞叶。尿嘧啶(批号100469-201302，质量分数为99.6%)，次黄嘌呤(批号140661-200402，质量分数为99.0%)，尿苷(批号887-200202，质量分数为100.0%)，腺嘌呤(批号110886-200001，质量分数为100.0%)，鸟苷(批号111977-201501，质量分数为93.6%)，腺苷对照品(批号110879-200202，质量分数为100.0%)，均购自中国食品药品检定研究院。胞苷(批号TI180107-17，质量分数为98.0%)，胸苷 (批号ML190825-06，质量分数为98.0%)，2′-脱氧腺苷对照品(批号AL181124-13，质量分数为98.0%)，均购自上海源叶生物科技有限公司。9批舞阳贝母样品信息见表1。

表1 舞阳贝母的样品信息

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱为YMC-Triart C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱(0～10 min，1%A～5%A；10～15 min，5%A～15%A；15～20 min，15%A～20%A；20～40 min，20%A～60%A)。柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：260 nm；进样量：10 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液 精密称取9种成分对照品各适量，加水溶解并定容至刻度，制成质量浓度分别为118.325、101.528、103.356、101.520、102.400、91.653、109.760、111.520、119.717 μg·mL-1的混合对照品溶液，于4 ℃冰箱内保存，备用。

2.2.2供试品溶液 精密称取样品粉末1.5 g，过3号筛，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加水10 mL，摇匀，称定质量，室温下超声提取60 min(功率300 W，频率50 kHz)，取出放冷至室温，补足减失的质量，摇匀，倒入离心管中，以8 000 r·min-1离心5 min，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3系统适用性实验 按照2.1项下色谱条件进样，供试品中各相邻色谱峰之间分离度除8号峰为1.4外，其余色谱峰分离度均大于1.5，理论塔板数均大于10 000，分离度良好，色谱图见图 1。

图1 HPLC图

2.4线性关系考察 精密吸取2.2.1项下制备的混合对照品溶液0.1、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、20.0 mL，分别置于7个20 mL量瓶中，加水稀释并定容至刻度，摇匀，制成系列质量浓度的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进样分析，记录其色谱图，以峰面积为纵坐标(y)、对照品质量浓度为横坐标(x)进行线性回归，建立回归方程，结果见表2。

表2 9种核苷类成分的线性方程和线性范围

2.5精密度实验 取2.2.1项下制备的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，记录9种成分的峰面积，计算得到其RSD值分别为1.23%、1.05%、0.85%、0.34%、0.67%、0.29%、0.34%、0.48%、0.98%，表明仪器精密度良好。

2.6重复性实验 精密称取样品(批号2019050802)粉末6份，每份1.5 g，按照2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定9种核苷类成分的含量，结果9种成分的RSD值分别为1.57%、1.86%、2.11%、0.98%、1.84%、1.49%、1.95%、1.36%、1.77%，表明本方法重复性良好。

2.7稳定性实验 取2.2.2项下制备的供试品溶液(批号2019050802)，分别于0、2、4、8、12、24、36 h进样测定，结果9种成分峰面积RSD值分别为0.91%、0.68%、0.87%、0.77%、0.94%、0.67%、0.75%、0.96%、0.72%，表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.8回收率实验 精密称取9种对照品各适量，分别加水溶解并定容至刻度，制成质量浓度分别为49.10、10.82、9.18、541.83、29.18、420.36、200.12、301.17、130.18 μg·mL-1的单一对照品溶液，备用。精密称取含量已知的样品(批号2019050802)共6份，每份0.75 g，分别精密加入上述单一对照品溶液各1 mL，加水至10 mL，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，测定含量，并计算回收率及RSD值，结果见表3。

表3 回收率实验结果 (n=6)

2.9样品含量测定 按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，结果见表4。

表4 含量测定结果 (n=3)

3 讨论

3.1提取条件的选择 核苷类物质极性较大，在有机溶剂中溶解性差，在供试品制备时考察了以下因素：不同提取溶剂(纯水以及体积分数分别为10%、20%、30%、40%、50%的甲醇)，不同溶剂用量(10、20、30 mL)，不同提取方法(超声和回流)，不同提取时间(30、60、90 min)，发现10 mL纯水超声处理60 min的结果与加热回流结果基本一致，提取率最高，且操作简便、重复性好，故选择加水10 mL超声处理60 min的方法制备供试品溶液。

3.2色谱条件的优化 本文比较了5种不同色谱柱：YMC-Triart C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Waters-Symmetrm C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agela-Venusil XBP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、JADE-PAKRS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，分别用甲醇和乙腈作为流动相，在不同的梯度洗脱条件下进样，也比较了不同进样量(5、10、15 μL)，不同流速(0.5、0.8、1.0 mL·min-1)，不同柱温(25、30、35 ℃)，最终根据色谱图基线、出峰数量、理论塔板数及分离度确定了2.1项下的色谱条件。

3.3检测波长的选择 采用DAD检测器在200～400 nm波长范围内对对照品及样品进行扫描，综合考虑不同波长下色谱峰的数量、紫外吸收、分离度和峰面积大小，最终选用260 nm作为最佳检测波长。

3.4测定结果分析 由表4测定结果可知，不同批次的舞阳贝母样品中9种核苷类成分含量差异较大，其中各批次中次黄嘌呤的含量普遍较低，鸟苷含量普遍较高。另外，本文采用的9批舞阳贝母样品是由3种不同产地加工方法加工而成，分别是硫磺熏蒸、传统炕制和烘箱烘干，由测定结果中9种核苷类成分的总含量可知，烘箱烘干的样品含量最高(1 876.33～2 257.12 μg·g-1)，其次是传统炕制(1 390.18～1 578.36 μg·g-1)，硫磺熏蒸的样品含量最低(1 007.22 μg·g-1)，可见不同产地加工方法对9种核苷类成分总含量影响较大，烘箱烘干损失较小，而硫磺熏蒸损失较大。舞阳贝母样品(批号2019080704)产地加工方法为硫磺熏蒸，9种核苷类成分总含量最低，且次黄嘌呤未检出，有文献报道显示，硫磺熏蒸不仅可使中药材及饮片残留大量的二氧化硫，还伴有复杂的化学反应，会导致多种有效成分的化学结构和含量发生改变[31-32]，由此推测，硫磺熏蒸处理可能导致舞阳贝母样品中次黄嘌呤含量普遍较低，样品(批号2019080704)各成分含量普遍下降、9种核苷类成分总含量下降且次黄嘌呤未检出。硫磺熏蒸对中药核苷类成分的影响及其作用机制有待进一步研究。

目前，对舞阳贝母化学成分的基础研究仍然很少，作为河南特色药材，其在民间传统用法是水煎剂，探讨舞阳贝母的水溶性核苷类成分，对考察其质量，保证其临床用药的稳定性和有效性具有重要意义。本文首次建立了舞阳贝母药材中9种核苷类水溶性成分的含量测定方法，使其水提取物中9种核苷类成分得到很好的分离，且精密度、重复性、稳定性均较好，为舞阳贝母的进一步开发利用提供科学依据。