不同基源崖桑皮及桑白皮总黄酮含量测定

黄艳萍，周 浓，田 平，谷文超，朱芙蓉，张德全，周 游*

(1. 重庆三峡学院 生物与食品工程学院，重庆 404120；2. 大理大学 药学院，云南 大理 671000；3. 宁夏回族自治区中卫市海原县科学技术局，宁夏 中卫 755200)

桑白皮为桑科植物桑[MorusalbaL.]的干燥根皮，入药可用于肺热喘咳，水肿胀满，尿少，面目肌肤浮肿，是2020版《中国药典》(一部)收载的药材[1]。崖桑皮为桑科植物鸡桑[MorusaustralisPoir.]或华桑[MoruscathayanaHemsl.]的干燥根皮，入药与桑白皮具有相似的功效，作为地方习用品主要在重庆、四川、贵州、广西等地使用，为2010版《四川省中药材标准》收载的药材[2]。随着中药材产业的发展及市场对中药材原料日益扩大的需求，中药材原料的多基源现象在一定时期内对扩大药源、满足成药需要、保障临床用药的需求具有重要的意义。然而不同基源的药材之间往往成分不同，品质参差不齐，难以用统一的标准控制质量，同时活性成分含量不同造成了生物活性的差异，难以保证临床疗效，严重影响了中药材的安全性、有效性和可控性。

在2020版《中国药典》中，桑白皮的鉴定方法仅为简单的薄层鉴定，即供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的两个荧光主斑点即可，未对其有效成分含量测定进行规定。而在2010版《四川省中药材标准》中，崖桑皮的质量鉴定则沿用了《中国药典》的标准，并且只对水分、灰分的含量进行了规定，尚无对其活性成分含量的质量控制标准。

黄酮类化合物是桑白皮中的药效物质基础[3]，具有降血压、降血脂、镇咳祛痰、抗病毒、抗癌、治疗骨质疏松[4-9]的作用。由于崖桑皮作为原料药入药时的安全与功效方面的技术标准与基础研究不足，迄今未形成完整的相关使用规范和技术标准。同时，有关鸡桑和华桑在化学成分方面是否存在明显差异，是否能等同入药尚缺少有力研究支撑。基于此，本研究以《中国药典》(2020年版)收载的桑白皮进行对照，首次对不同基源的崖桑皮进行了有效化学成分比较，采用紫外-可见光分光光度法对不同基源的崖桑皮和桑白皮中总黄酮的含量进行了测定，以期进一步规范和完善崖桑皮药材的质量评价方法，为药材标准的修订提供科学依据，也为其它多基源中药的品质评价提供示范。

1 材料与仪器

1.1 仪器

UV-2450型紫外可见分光光度计(日本岛津集团)；SB-5200DTN型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；TDZ5-WS型多管架自动平衡离心机(湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司)；ML204型分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；DZF-6050MBE型电热恒温真空干燥箱(上海博讯实业有限公司)；CP225D型分析天平(德国Sartorius公司)。

1.2 试药

对照品桑辛素(批号：DST180729-069，纯度：98%)购自成都德斯特生物技术有限公司，甲醇(批号：MFCD00004595)、冰乙酸(批号：MFCD00036152)、乙酸钠(批号：MFCD00012459)、氯化铝(批号：MFCD00149134)购自南京试剂有限公司，均为分析纯。

1.3 材料

桑、鸡桑、华桑于2018年10月采集于重庆市相关区县，共53批(表1)，对照药材购自相关中药材市场及公司，经重庆三峡学院生物与食品工程学院周浓教授鉴定为桑科植物鸡桑(M.australis)、华桑(M.cathayana)、桑(M.alba)。根皮洗净后置于45℃烘干至恒重，粉碎，密封储存于4℃，用于品质分析，待用。

表1 不同产地的样品信息Table 1 The information of samples from different origins

2 方法与结果

参照杨晶[10]等条件并加以改进，具体操作如下。

2.1 对照品溶液制备

取适量的桑辛素对照品，精密称量至0.000 1 g，用80%甲醇将其稀释为80 μg·mL-1即得。

2.2 显色方法

取1.0 mL对照品溶液于10 mL比色管中，分别加入0.1 mol·L-1氯化铝溶液2.0 mL和0.1 mol·L-1乙酸钠-乙酸溶液3 mL，用甲醇定容至刻度，摇匀，室温下放置10 min进行显色反应。利用紫外-可见分光光度计测定其吸光度，在350～500 nm波长范围内进行波长扫描，结果发现在400 nm波长处有强吸收(图1)。因此，选择总黄酮的检测波长为400 nm。

图1 桑辛素的光谱扫描图Fig.1 UV wavelength selection of morusin

2.3 线性关系考察

精密吸取桑辛素对照品溶液0.025、0.125、0.375、0.75、1.0 mL，按照2.2项下的方法进行显色反应，于400 nm波长处测定吸光度。以桑辛素对照品的浓度(0.2、1.0、3.0、6.0、8.0 μg·mL-1)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，回归方程为y=0.013x+0.009 1，R2=0.999 9。由结果可知，桑辛素的在2～80 μg·mL-1的线性关系良好。

2.4 提取溶剂考察

分别考察不同体积浓度(30%、50%、70%、80%、100%)甲醇、乙醇溶液的提取效果。精密称取桑白皮粉末0.5 g，置具塞锥形瓶中，加上述溶剂50 mL，超声提取30 min后取出，以4 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液，取1.0 mL按照2.2项下的方法进行显色反应并测量。结果显示，提取溶剂为80%甲醇的提取效果最佳(表2)。

表2 不同提取溶剂比较Table 2 Comparison of different extraction solvents

2.5 提取时间考察

精密称取药材粉末0.5 g，置具塞锥形瓶中，加80%甲醇50 mL，分别超声15、30、45、60 min后取出，以4 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液1.0 mL按照2.2项下的方法进行显色反应、测量。结果如表3所示，超声提取45 min的提取效果最佳(表3)。

表3 不同提取时间比较Table 3 Comparison of different extraction times

2.6 提取次数考察

取药材粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加80%甲醇50 mL，分别超声45 min 1次、2次、3次后取出，以4 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液1.0 mL按照2.2项下的方法进行显色反应并测量。结果如表4所示，提取1次即可达到最佳效果(表4)。

表4 不同提取次数比较Table 4 Comparison of different extraction frequencies

2.7 供试品溶液的制备

综合前述单因素试验结果，精密称取药材粉末0.5 g，置具塞锥形瓶中，加80%甲醇50 mL，超声提取45 min，冷却，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量后取出，以4 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液1.0 mL待显色。

2.8 精密度考察

精密吸取同一供试品溶液1.0 mL，平行6份，按2.2项下的方法显色后，测定吸光度并计算总黄酮含量，结果显示各样品吸光度的RSD为0.095 %(表5)，表明仪器精密度良好。

表5 精密度考察Table 5 Precision study

2.9 稳定性考察

精密吸取对照品溶液、供试品溶液各1.0 mL，按2.2项下的方法显色后，分别在0、20、40、60、80、100、120 min时测定吸光度并计算总黄酮含量。结果显示各时间段吸光度的RSD为0.363%(表6)。表明在2 h内稳定性良好。

表6 稳定性考察Table 6 Stability study

2.10 加样回收试验

取已知含量的崖桑皮药材粉末0.25 g，精密称定，加入30 μg·mL-1的桑辛素对照品溶液1.0 mL，平行6份，按2.7项下制备供试品溶液，2.2项下的方法显色后测定吸光度。结果显示，平均回收率为101.641%，RSD为2.670%，符合分析要求(表7)。

表7 加样回收试验Table 7 Sample recovery test

2.11 样品测定

取58批药材按照2.7项下制备供试品溶液，2.2项下的方法显色后测定吸光度，计算总黄酮含量，详见表8。结果可知，崖桑皮中总黄酮的含量为9.731～54.706 mg·g-1，平均含量为33.329 mg·g-1，其中华桑根皮中总黄酮的含量为16.479～54.706 mg·g-1，平均含量为32.669 mg·g-1；鸡桑根皮中总黄酮的含量为9.731～50.464 mg·g-1，平均含量为34.651 mg·g-1。桑白皮中总黄酮的含量为20.149～75.090 mg·g-1，平均含量为40.521 mg·g-1。

表8 总黄酮的含量比较Table 8 Comparison of total flavonoids ± s, n =3)

2.12 独立样品t检验

采用软件SPSS 22.0对全部样品进行独立样本t检验分析，观察崖桑皮与桑白皮之间总黄酮含量之间的差异、来源于鸡桑的崖桑皮与桑白皮之间总黄酮含量的差异、来源于华桑的崖桑皮与桑白皮之间总黄酮含量的差异以及来源于鸡桑和华桑的崖桑皮之间总黄酮含量的差异。结果表明，崖桑皮与桑白皮之间总黄酮含量不存在显著差异，分别来源于华桑和鸡桑的崖桑皮之间总黄酮含量不存在显著差异，来源于鸡桑的崖桑皮与桑白皮之间总黄酮含量不存在显著差异，而来源于华桑的崖桑皮与桑白皮之间总黄酮含量存在显著差异(表9)。

表9 独立样品t检验Table 9 Independent t-test

3 讨 论

紫外分光光度法测定药材有效成分的方法具有简便、快捷、准确、可靠的特点。参考杨晶[10]等的方法，以桑辛素为对照品测定了野生鸡桑、华桑、桑的根皮，对照药材崖桑皮、桑白皮等共计58批药材中总黄酮的含量，并对前人的方法做了调整改进。本研究首次对崖桑皮药材有效成分的含量进行了测定，填补了以往关于崖桑皮质量检测的空白。结果显示，鸡桑、华桑、桑的根皮中总黄酮含量多数在20～40 mg·g-1之间，野生桑根皮中的总黄酮含量均高于对照药材桑白皮中总黄酮的含量；除Y28外，野生鸡桑、华桑根皮中的总黄酮含量基本高于对照药材崖桑皮中总黄酮的含量；t检验的结果则表明崖桑皮与桑白皮之间总黄酮含量不存在显著性差异，在一定程度上具有质量等同性，分别来源于鸡桑和华桑的崖桑皮之间总黄酮含量显著性差异，可以作为多基源药材的保证。