雷公藤甲素-BSA完全抗原的合成与鉴定

重庆师范大学生命科学学院 蔡娜 付晨燕 于元蕾 王林玲

引言

雷公藤甲素（Triptolide）是从雷公藤的根、叶、花及果实中提取的一种环氧二萜内酯化合物，与雷公藤碱、雷公藤次碱等生物碱构成了雷公藤提取物的主要活性成分[1-2]。其性质为难溶于水，易溶于甲醇、无水乙醇、氯仿等[3]。具有显著调节免疫、抗炎、抗生育及抗肿瘤等作用[4-6]，但雷公藤甲素自身水溶性差，治疗窗窄，对消化、泌尿和血液系统等都有较大的毒副作用。因此在临床上的应用受到限制[7-8]。

当天气干旱、外界蜜源稀少时，蜜蜂更倾向于采集一些有毒植物的花蜜，多数以雷公藤植物或昆明山海棠的花蜜为主。雷公藤植物的主要活性成分是雷公藤二萜类、三萜类和生物碱类，其中毒性较强的是雷公藤二萜类，代表性物质为雷公藤甲素，蜜蜂采集了雷公藤植物或昆明山海棠的花蜜，会导致主要的二萜类毒性成分雷公藤甲素进入蜂蜜中。如果人们误食此类蜂蜜，可引起中毒甚至死亡。因此建立雷公藤甲素的快速分析方法是非常必要的。

免疫分析是基于抗原和抗体之间的特异性反应，具有特异性高、灵敏度高、操作简便快速等优点。由于雷公藤甲素是小分子化合物，不能直接用于抗体制备，而是需要和蛋白质连接形成完全抗原。本文主要研究雷公藤甲素和牛血清白蛋白（BSA）反应合成完全抗原。

1 材料与方法

1.1 材料

雷公藤甲素购自macklin，琥珀酸酐、碳二亚胺盐酸盐购自阿拉丁，牛血清白蛋白（BSA）购自J&Kchemical，钥孔嘁血蓝蛋白（KLH）购自Solarbio。

1.2 方法

1.2.1 完全免疫抗原的合成

10mgGTP和5mgcBSA溶解在500μlTEbuffer(pH8.2)中，在涡旋器上充分震荡使其溶解，再取EDC·HCI160mg充分溶解于500μlTEbuffer（pH8.2）中。将GTP和15mgBSA的混合溶液边震荡边逐滴加入EDC溶液，然后将磁力搅拌器温度设置为37℃，将其溶液充分反应4个小时。用Sephadex柱分离偶联产物和未结合的GTP小分子，透析纯化，将1ml溶液在PBS中透析3d，于-20℃保存备用。

2 结果与分析

2.1 雷公藤甲素水溶性分子GTP的合成

TP在弱碱性条件下和琥珀酸酐进行酰化反应,是在目标物“-OH”处进行半抗原改造，改造后在该位点上增加“4个C（碳）”长度的间隔臂（该臂带有-COOH），得到水溶性分子GTP，如图1所示

图1 GTP的结构合成

2.2 雷公藤甲素-BSA的合成与鉴定

GTP与BSA通过碳二亚胺法结合，GTP半抗原含有一个活性羧基，该羧基通过典型的EDC将载体蛋白进行偶联。雷公藤甲素活化后与BSA偶联后的终产物进行飞行时间质谱检测如图2所示,偶联终产物的出峰时间比牛血清白蛋白出峰时间晚，如图3所示说明偶联终产物分子量比牛血清白蛋白分子量明显,偶联成功。

图2 雷公藤甲素-BSA飞行时间质谱

图3 BSA蛋白飞行时间质谱

3 讨论

目前用于雷公藤甲素的检测分析主要为仪器分析法，包括LC-MS/MS法、色谱等方法，具有灵敏度与精密度高的特点，但仪器设备昂贵且操作复杂。近年发展起来的免疫检测法则克服了这些缺点，且操作简便、高效、灵敏度高、特异性强。半抗原的设计、修饰（如何合成端基为功能基团且具有一定长度的连接臂）和人工抗原的制备（将半抗原修饰物与载体偶联）是制备小分子化合物抗体的前提，是建立相应免疫分析方法的必要环节。本试验采用已报道的雷公藤甲素完全抗原的制备方法，利用EDC法将GTP和牛血清白蛋白偶联，用飞行时间质谱检测显示偶联成功，从而为发展雷公藤甲素的免疫检测方法做了基础研究。