应用无动物来源成分培养脐带间充质干细胞的研究

姬广超，王晓明，刘 倩，苏苗苗，王玉琪

（上海安库生医生物科技有限公司，上海 201318）

间充质干细胞来源于中胚层，具有自我更新和多向分化的能力。间充质干细胞多被应用于下肢缺血性疾病、心肌梗死、I型糖尿病、硬皮病、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病、肝损伤疾病、神经系统损伤疾病、眼部疾病等多种疾病的治疗及造血干细胞移植中。最初，骨髓是人类间充质干细胞的主要来源。随着时间推移，陆续发现间充质干细胞可从脂肪组织、牙组织、皮肤及包皮、唾液腺、胎儿肢芽、经血和围产期组织等多种组织中分离出来[1]。围产期组织中的脐带组织是分娩胎儿后产生的一种废弃物。脐带组织中含有丰富的间充质干细胞，且具有获取方便、易于分离培养等优势。脐带间充质干细胞是干细胞治疗药物研究中的热点。截至2020年10月底，在国家药品监督管理局药品审评中心公布的药物临床试验受理目录中，干细胞（不包括干细胞因子）治疗用生物制品临床试验申请有27项（不区分申请类型），其中脐带间充质干细胞治疗用生物制品临床试验申请有14项。以往，多使用胎牛血清、动物来源的胰蛋白酶等动物来源成分培养脐带间充质干细胞。用此法培养的脐带间充质干细胞具有异种蛋白免疫原性风险及潜在的病毒传播风险。2017年，国家药品监督管理局发布的《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》中指出：“细胞培养过程中，应尽量避免使用动物或人来源的物质，比如应尽量避免血清的使用，若必须使用血清，需要提供相关的研究资料说明使用的必要性和合理性；严禁使用疫病流行区来源的动物血清；不得使用未经过安全性验证的血清。”本研究使用无动物来源成分的血清替代物EliteGroTM-Adv替换胎牛血清、无动物来源成分的重组酶TrypLETMExpress替换动物来源的胰蛋白酶组成的无动物来源成分培养方案培养脐带间充质干细胞，并鉴定采用该方案培养脐带间充质干细胞的效果。

1 仪器与试剂

本文中使用的仪器为博迅公司生产的高压灭菌锅、Heal Force公司生产的A2型生物安全柜、Heal Force公司生产的二氧化碳培养箱、贝克曼公司生产的流式细胞仪及湘仪公司生产的离心机。本文中使用的试剂为Elitecell公司生产的EliteGroTM-Adv、达科为公司生产的MSCBM、Thermo Scientific公司生产的TrypLETMExpress、埃泽思公司生产的无血清细胞冻存液及安徽双鹤药业生产的生理盐水。

2 方法

2.1 组织处理

选择产前艾滋、梅毒、乙肝及丙肝传染四项检查结果呈阴性的供体，在孕产妇分娩胎儿后，获取其废弃的脐带组织。使用生理盐水清洗3遍脐带组织，将其剪成长2～3 cm的小段。撕去脐带组织的外皮和内部的三根血管，使用生理盐水清洗脐带组织，将其剪成大小为1～3 mm3的小块。将脐带组织摆放至100 mm的培养皿中，每块脐带组织的间距为0.5 mm。将培养皿倒置30 min后，摆正培养皿。向培养皿中加入2～3 mL的完全培养基（含浓度为5%的血清替代物MSCBM），润湿每块脐带组织。静止24 h后，向培养皿中补加完全培养基，覆盖每块脐带组织。每3天为培养皿更换1次完全培养基。

2.2 消化传代

当大部分的脐带组织边缘有间充质干细胞爬出，且培养皿中脐带间充质干细胞的汇合度为70%～90%时，对其进行消化处理。轻轻晃动培养皿，使脐带组织块脱离培养皿底部，弃去上清液（含脐带组织块）。使用生理盐水清洗1～2遍培养皿。向培养皿中加入TrypLETMExpress至覆盖脐带组织中间充质干细胞的表面。在37℃的环境下，对脐带组织进行5～8 min的消化处理。5～8 min后，向培养皿中加入等体积的生理盐水，终止消化程序。收集细胞悬液，对其进行离心处理后计数，将其以5000～8000个/cm2/mL的密度接种于培养皿中。细胞若为冻存后复苏细胞，可适当提高其接种密度。当培养皿中脐带间充质干细胞的汇合度为80%时，对其进行传代培养。

2.3 收获冻存

将脐带间充质干细胞培养至目标代次时，收获脐带间充质干细胞。收获后计数，取样送检。使用无血清细胞冻存液按照规定浓度将其余脐带间充质干细胞冻存于气相液氮罐中。

2.4 细胞表型检测

使用流式细胞仪检测脐带间充质干细胞中CD73分子、CD90分子、CD105分子、CD11b分子、CD19分子、CD34分子、CD45分子及HLA-DR分子等标志物的表达。

2.5 细胞诱导分化检测

向MSCBM培养基中加入终浓度为10%的胎牛血清、1 μM的地塞米松、0.5 mM的IBMX、50 μg/mL的吲哚美辛及10 μg/mL的胰岛素，将其配制成成脂诱导培养基。向MSCBM培养基中加入终浓度为10%的胎牛血清、0.1 μM的地塞米松、50 μg/mL的L-抗坏血酸及10 mM的β-甘油磷酸钠，将其配制成成骨诱导培养基。向MSCBM培养基中加入终浓度为1%的ITS液体培养基补充剂（100x）和10 ng/mL的转化生长因子β1，将其配制成成软骨诱导培养基。将待测的脐带间充质干细胞按照2×104个/cm2/mL的密度接种于12孔培养板中。向每个接种脐带间充质干细胞的孔中加入1 mL的完全培养基。当培养皿中脐带间充质干细胞的汇合度为80%～100%时，去除培养板孔中的完全培养基，向培养板孔中加入诱导培养基，每隔2～3天更换1次诱导培养基。3周后，使用油红O染色法对成脂诱导培养基中的脐带间充质干细胞进行鉴定，使用茜素红染色法对成骨诱导培养基中的脐带间充质干细胞进行鉴定，使用阿尔新蓝染色法对成软骨诱导培养基中的脐带间充质干细胞进行鉴定。

3 结果

3.1 脐带间充质干细胞的形态

当脐带组织块贴壁后，其组织边缘开始有间充质干细胞贴壁爬出。脐带间充质干细胞的爬出速度因供体不同而存在差异。脐带间充质干细胞的爬出速度较快时，在培养后第3天即可见脐带组织中开始有间充质干细胞爬出。脐带间充质干细胞的爬出速度较慢时，在培养后第9天才可见脐带组织中开始有间充质干细胞爬出。脐带间充质干细胞呈梭形贴壁爬出，进行传代后3～4天即可长满整个培养容器，其增殖倍数为3～8倍。详见图1。

图1 脐带间充质干细胞的形态

3.2 细胞表型检测的结果

对脐带间充质干细胞进行细胞表型检测的结果显示其中CD73分子、CD90分子及CD105分子呈高表达（阳性率≥95%）；其中CD11b分子、CD19分子、CD34分子、CD45分子及HLA-DR分子呈低表达（阳性率≤2%），甚至不表达。详见表1、图2。

图2 细胞表型检测的结果

表1 细胞表型检测的结果（%）

3.3 细胞诱导分化检测的结果

对脐带间充质干细胞进行细胞诱导分化检测的结果显示其具有成脂、成骨及成软骨的能力。详见图3。

图3 细胞诱导分化检测的结果（从左至右依次为进行成脂、成骨及成软骨诱导分化染色的结果）

4 讨论

2006年，国际细胞治疗协会提出了鉴定间充质干细胞的最低标准：首先，在标准的培养条件下，其在塑料培养容器上贴壁生长；其次，CD73分子、CD90分子及CD105分子的阳性率≥95%，CD45分子、CD34分子、CD14分子或CD11b分子、CD79α分子或CD19分子及HLA-DR分子的阳性率≤2%；最后，其在体外具有分化成为脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞的能力[2]。2005年，Doucet等提出血小板裂解物可作为动物血清的替代品用于间质干细胞的体外扩增。Becherucci V等[3]证实，血小板裂解物可促进间充质干细胞的增殖，不影响其免疫表型、免疫调节能力、分化潜能及端粒相对长度。李炳尧等[4]认为，人血小板裂解液培养基可以满足脐带间充质干细胞体外培养与扩增的需求，而且较于胎牛血清培养基，人血小板裂解液培养基在用于大规模扩增脐带间充质干细胞方面有明显的优势。TrypLETMExpress是一种无动物来源成分的重组酶。Tsuji K等[5]实验证实，TrypLETMExpress可在5 min内快速消化间充质干细胞，且消化30 min内不影响间充质干细胞的表型。本文使用由无动物来源成分的血清替代物替代胎牛血清、无动物来源成分的重组酶替代动物来源的胰蛋白酶及无血清细胞冻存液组成的无动物来源成分培养方案培养脐带间充质干细胞，并对培养的脐带间充质干细胞进行检测。检测结果显示，使用无动物来源成分培养方案培养脐带间充质干细胞的质量完全满足国际细胞治疗协会提出的间充质干细胞质量的最低标准，且可大量扩增。

综上所述，使用无动物来源成分培养脐带间充质干细胞的质量完全满足国际细胞治疗协会提出的评估间充质干细胞质量的最低标准。使用该方案生产脐带间充质干细胞可极大地提高脐带间充质干细胞临床研究和临床应用的安全性，能够为相关细胞产品的生产、研究与应用提供一个优选方案。