昆虫病原线虫对恩施地区银杏蛴螬的致病性研究

张维伟，赵福永

（1.长江大学 生命科学学院,湖北 荆州 434025；2.利川市农业农村局,湖北 恩施 445400）

银杏是一种重要的多用途经济林木，其叶富含黄酮类化合物，叶提取物广泛应用于医药、食品、保健品、化妆品等行业［1-4］。银杏幼苗在生长发育过程中，其幼嫩根茎易受到以蛴螬为主的地下害虫的啃食，造成根茎受损，甚至腐烂，严重影响水分及养分运输，从而导致植株落叶早或萎黄，甚至死亡，不利于银杏的规模化种植。蛴螬是金龟子类幼虫的总称，其防治方法主要有化学防治、物理防治及生物防治等，而生物防治因防治效果好、成本低、环保等优点，具有极大的推广应用前景。目前，国内外的生物防治主要是利用昆虫病原线虫的侵染致病、致死作用。昆虫病原线虫是一类专门寄生于昆虫体内的线虫，可释放共生菌使昆虫患败血症而死亡，不污染环境，且对人畜安全，可用于蛴螬等害虫的防治［5］。

国外内已有较多使用昆虫病原线虫防治蛴螬的研究与报道。李根等［6］对5 个昆虫病原线虫种类对小地老虎致病力的比较研究发现，斯氏线虫对小地老虎致死速度最快，侵染72 h 后的死亡率为86.7%，96 h 后的死亡率达100%。武海斌等［7］利用嗜菌异小杆线虫H06 在花生结荚期施用，对蛴螬的防治效果达80.78%。Ansari［8］和李小峰［9］分别研究了S.feltiae对鞘翅目害虫的防治有较好效果。张中润［10］等研究发现，S.longicaudum对高尔夫球场的蛴螬具有较好的防治效果。然而，截止目前，国内还未见有利用昆虫病原线虫防治银杏蛴螬的相关报道。

本研究从恩施地区银杏种植区土壤中分离获得了2 种昆虫病原线虫，并探讨了其在不同条件下对银杏蛴螬的致病性，为后期利用昆虫病原线虫防治银杏蛴螬技术及生物防治制剂的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 昆虫病原线虫的分离与鉴定

1.1.1 土样采集

2018 年7 月和10 月，用土样采集器在利川林业局甘溪山银杏GAP 基地采集了表层土以下10～20 cm的土样，采集地土壤质地以壤土为主，共计30 份，每份1 kg 左右。土样混合均匀后用密封袋封装并带回实验室，常温保存。

1.1.2 昆虫病原线虫的诱集

参考White［11］和Bedding 等［12］方法，利用大蜡螟作为活体寄主诱集土样中的昆虫病原线虫。具体操作步骤为：每份土样取200 g 装进塑料盒（长15 cm，宽8 cm，高3.5 cm）中，每塑料盒中放入5 头大蜡螟末龄幼虫，然后置于20～25 ℃的条件下。5 d 后收集大蜡螟尸体，并将虫尸转至线虫收集盘收集昆虫病原线虫的侵染期幼虫，每份土样诱集3 次。

1.1.3 昆虫病原线虫的纯化、保存与鉴定

将收集到的侵染期幼虫倒入200 mL 烧杯中，加入适量灭菌水，静置30 min；去除上层水，重复4～5 次，直至水变清澈。将净化后的幼虫悬浮液置于8～12 ℃保存。每隔3个月用大蜡螟末龄幼虫重新繁殖一次线虫［13］。

采用大蜡螟末龄幼虫对诱集到的昆虫病原线虫进行活体繁殖后，按照下列步骤和标准进行形态学鉴定。待大蜡螟死后第3～4 d解剖尸体，收集成虫［14］；然后在60 ℃Ring 溶液中浸泡3 min 杀死待测成虫，并用FA 固定液固定［15］；选取约30 只待测成虫，在显微镜下进行观测，参照Hominick 等［16］报道的参数确定线虫种类。

1.2 致病性昆虫病原线虫的筛选

1.2.1 供试虫源

供试线虫为本试验通过大蜡螟末龄幼虫诱集并纯化所获得。供试金龟子幼虫均为本实验室于2019年5 月—7 月间在利川林业局甘溪山银杏GAP 基地诱捕获的铜绿丽金龟和暗黑鳃金龟成虫经饲养获得。饲养方法：成虫产卵后，将卵放置到装有15%左右湿度土壤的培养皿中，置于25 ℃恒温箱中孵化，待卵孵化后，将幼虫置于15%～18%湿度土壤的牙签盒中，25℃环境下饲养，以马铃薯块为饲料，饲养至所需龄期备用，为保证饲养条件稳定，每隔20 d 左右对土壤和饲料进行更换。

1.2.2 昆虫病原线虫悬浮液制备

取昆虫病原线虫溶于一定量蒸馏水（如100 mL）中，用磁力搅拌器搅拌均匀后取1 mL 悬浮液进行计数，以5 次观测的平均值计算昆虫病原线虫悬浮液浓度。用蒸馏水调整线虫悬浮液终浓度至500 IJs/mL，置于8～12 ℃保存备用。

1.2.3 致病性线虫筛选

分别将20 头金龟子1 龄幼虫和若干0.5 cm3大小的马铃薯块置于牙签盒（直径4 cm，高8 cm，下同）底，并加入灭菌壤土（含水量为18%，过40 目筛，下同）50 g，最后滴加浓度为500 IJs/mL 的线虫悬浮液40 μL，以滴加等量无菌水作为对照。每处理重复3 次。为保证空气流通，牙签盒密封后在盒盖上留小孔，同时各处理置于同一恒温箱中，温度为25 ℃、相对湿度为80%。分别于处理后24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 检查蛴螬的死亡情况并计算校正死亡率。

1.3 昆虫病原线虫对银杏蛴螬的致病力测定

1.3.1 供试虫源

选取1.2 中筛选得到的致病力较强的昆虫病原线虫进行致病力测定，供试蛴螬为2019 年5 月—7 月间在利川林业局甘溪山银杏GAP 基地诱捕获得。

1.3.2 不同剂量的昆虫病原线虫对铜绿丽金龟的致病力

将500 IJs/mL 的线虫悬浮液稀释成400 IJs/mL、300 IJs/mL、200 IJs/mL 和100 IJs/mL 等4 个浓度，以滴加无菌水作为对照，共5 个处理组，各取40 μL 线虫悬浮液稀释分别加入到装有20 头金龟子1 龄幼虫的牙签盒（内含马铃薯块和灭菌土，同1.2.3）内，每处理重复3 次。将各处理置于同一恒温箱中，温度为25 ℃、相对湿度为80%。分别于处理后24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 检查记录蛴螬死亡情况并计算死亡率。

1.3.3 不同温度下昆虫病原线虫对铜绿丽金龟的致病力

根据1.3.2 试验结果，取6 个均含有20 头铜绿丽金龟1 龄期幼虫、马铃薯块及50 g 灭菌土（含水量为18%）的牙签盒，将40 μL 浓度为300 IJs/mL的线虫悬浮液滴加各牙签盒（牙签盒的处理同1.2.3） 中，每处理重复3 次，各处理分别置于10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃的恒温箱中培养，恒温箱湿度均为80%，分别于处理后24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 检查记录蛴螬死亡情况并计算死亡率。

1.3.4 不同土壤湿度下昆虫病原线虫对铜绿丽金龟的致病力

根据1.3.3 试验结果，取5 个均含有20 头铜绿丽金龟1 龄期幼虫、马铃薯块及50 g 灭菌土的牙签盒，将40 μL 浓度为300 IJs/mL 的线虫悬浮液滴加各牙签盒（牙签盒的处理同1.2.3）中，各牙签盒里灭菌土的水分含量分别用无菌水调节为3%、6%、9%、18%和36%，每处理重复3次，各处理置于同一恒温箱中，温度为25℃、相对湿度为80%。分别于处理后24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 检查记录蛴螬死亡情况并计算死亡率。

1.4 数据统计分析

采用SPSS19.0 和Excel 2010 软件进行统计数据分析，昆虫病原线虫对蛴螬的致病力用蛴螬校正死亡率或死亡率表示。

2 结果与分析

2.1 昆虫病原线虫的分离、鉴定与筛选

2.1.1 昆虫病原线虫的分离

利用大蜡螟末龄幼虫对2批次土样进行昆虫病原线虫活体诱集，成功诱集到了2 种昆虫病原线虫的幼虫，编号分别ES7-1 和ES10-1。

2.1.2 昆虫病原线虫的形态学鉴定

ES7-1 和ES10-1 的各项形态学观测数据如表1 所示。与Hominick 等［16］报道的数据比较发现，ES7-1和ES10-1 的主要形态特征分别与斯氏线虫和嗜菌异小杆线虫最为接近。因此，本研究将ES7-1和ES10-1分别初步鉴定为斯氏线虫和嗜菌异小杆线虫。

表1 2 种待鉴定昆虫病原线虫的成虫与4 种昆虫病原线虫的形态比较Table 1 Comparison of morphology between adults of 2 species of Entomopathogenic nematodes and 4 species of Entomopathogenic nematodes

2.1.3 致病性昆虫病原线虫的筛选

2 种昆虫病原线虫对铜绿丽金龟1 龄幼虫的致病力结果如表1。供试的2 种昆虫病原线虫对铜绿丽金龟1 龄幼虫的致病力在处理后24～48 h 时差异较小，金龟子的校正死亡率均低于10%。随着线虫侵染时间延长，2 种昆虫病原线虫对铜绿丽金龟1 龄幼虫的致死率均呈递增趋势。在感染斯氏线虫96 h 和120 h后，铜绿丽金龟1龄幼虫的其校正死亡率分别为61.67%和86.67%，显著高于感染嗜菌异小杆线虫后的校正死亡率（46.67%和61.67%）。

2 种昆虫病原线虫对暗黑鳃金龟1 龄幼虫的致病力结果如表2。供试的2 种昆虫病原线虫对暗黑鳃金龟1 龄幼虫的致病力在处理后24～48 h 时差异较小，金龟子的校正死亡率均低于10%。随着线虫侵染时间延长，2 种昆虫病原线虫对暗黑鳃金龟1 龄幼虫的致死率均呈递增趋势。在感染斯氏线虫96 h 和120 h后，暗黑鳃金龟1龄幼虫的校正死亡率分别为55.00%和78.33%，显著高于感染嗜菌异小杆线虫的校正死亡率（45.00%和56.67%）。

表2 2 种昆虫病原线虫对铜绿丽金龟1 龄幼虫致病力Table 2 Pathogenicity of two species of Entomopathogenic nematodes to the 1st instar larvae of A.corpulenta

表3 2 种昆虫病原线虫对暗黑鳃金龟1 龄幼虫致病力Table 3 Pathogenicity of two species of Entomopathogenic nematodes to the 1st instar larvae of H.parallela

通过筛选试验得出，斯氏线虫对2种金龟子的致病力高于嗜菌异小杆线虫的致病力。同时，斯氏线虫对铜绿丽金龟1 龄幼虫的致病力要明显高于对暗黑鳃金龟1 龄幼虫的致病力。

2.2 影响斯氏线虫对铜绿丽金龟致病力的因素

2.2.1 不同侵染剂量对斯氏线虫对铜绿丽金龟致病力的影响

同一温度和土壤湿度条件下，不同侵染剂量的斯氏线虫对铜绿丽金龟的致病力结果如图1 所示。从图中可以看出，斯氏线虫侵染铜绿丽金龟幼虫24 h时，仅当线虫剂量为300 IJs/mL时，金龟子幼虫出现死亡，死亡率为10%；随着侵染时间延长，各剂量浓度的斯氏线虫对铜绿丽金龟幼虫的致死率均增加；相同侵染时长下，线虫剂量为300 IJs/mL 的致死率均要高于其它剂量处理组，在120 h时达最高值，为98.33%；当侵染时间在48～96 h之间时，100 IJs/mL、200 IJs/mL、400 IJs/mL 和500 IJs/mL 剂量处理对绿丽金龟幼虫的致死率差异较小；其次为400 IJs/mL剂量，500 IJs/mL剂量线虫对绿丽金龟幼虫的致病力最弱，死亡率仅为45.00%。

图1 不同侵染剂量的斯氏线虫对铜绿丽金龟的致病力Fig.1 Pathogenicity of different infection doses of S.carpocapsae to A.corpulenta

2.2.2 不同温度对斯氏线虫对铜绿丽金龟致病力的影响

相同侵染剂量，同一土壤湿度条件下，不同温度条件下斯氏线虫对铜绿丽金龟幼虫的致病力结果如图2 所示。随着侵染时间延长，不同温度条件下，斯氏线虫对铜绿丽金龟幼虫的致死率均增加；在25 ℃条件下，斯氏线虫对铜绿丽金龟幼虫致病力最强，当侵染120 h后，铜绿丽金龟幼虫的死亡率为96.67%；在10 ℃条件下，斯氏线虫对铜绿丽金龟幼虫致病力最弱，当侵染120 h 后，铜绿丽金龟幼虫的死亡率仅为28.33%；同一侵染时间内，20 ℃和30 ℃、15 ℃和35 ℃条件下，斯氏线虫对铜绿丽金龟幼虫致病力差异较小。

图2 不同温度下斯氏线虫对铜绿丽金龟的致病力Fig.2 Pathogenicity of S.carpocapsae to A.corpulenta at different temperatures

2.2.3 不同土壤湿度对斯氏线虫对铜绿丽金龟致病力的影响

相同侵染剂量和同一温度条件下，不同土壤湿度条件下斯氏线虫对铜绿丽金龟幼虫的致病力结果如图3 所示。结果表明：随着侵染时间延长，不同土壤湿度条件下，斯氏线虫对铜绿丽金龟幼虫的致死率均增加；当土壤湿度为18%时，斯氏线虫对铜绿丽金龟幼虫的致病力较其他浓度条件强，当侵染120 h后，金龟子死亡率为93.33%；当侵染48～72 h 后，土壤湿度为3%、6%和9%时，线虫对铜绿丽金龟幼虫的致病力差异较小；当侵染120 h后，土壤湿度为3%时，斯氏线虫对铜绿丽金龟幼虫的致病力最弱，金龟子幼虫死亡率为51.67%，当土壤湿度为9%和36%时，线虫对铜绿丽金龟幼虫的致病力差异较小。

图3 不同土壤湿度下斯氏线虫对铜绿丽金龟的致病力Fig.3 Pathogenicity of S.carpocapsae to A.corpulenta at different soil humidity

3 讨论

蛴螬是金龟子类幼虫总称，一般以植株地下块茎和嫩根为食，导致农作物水分断流、营养运输受阻，使植株生长不良，甚至死亡。蛴螬发生与地势、气象条件、土壤条件、种群数量及为害时期关系密切［17,18］。蛴螬防治方法包括化学防治、物理防治及生物防治。化学防治操作方便且见效快，但具有高毒性、高残留特点，不仅对环境造成污染，还会影响人类健康。物理防治是利用金龟子趋光性，通过白炽灯或紫外灯达到诱杀目的，是防治蛴螬成虫的有效方法。生物防治主要是利用昆虫病原微生物、昆虫病原线虫感染蛴螬，诱发蛴螬幼虫死亡而发挥防治作用［19-23］。昆虫病原线虫具有可大量生产、防治效果好等优势，是未来我国生物防治蛴螬的重要发展方向。

不同种类的线虫对蛴螬的致病力不同，本文通过筛选得出，斯氏线虫对本地蛴螬的致病力强于嗜菌异小杆线虫的致病力，可能与昆虫病原线虫的活动力强弱有密切关系［24］。室内测试结果表明，当侵染剂量为300 IJs/mL 时，斯氏线虫对铜绿丽金龟幼虫致病力最强，说明昆虫病原线虫能否有效控制害虫与其在土壤中存活的基数相关，基数过大或者过小，均会影响其整体致病力。其次，随着侵染时间延长，病原线虫对金龟子的致病力均加强，但当侵染时间为48～96 h 之间时，线虫剂量为300 IJs/mL 的致死率显著高于其他组，可能因病原线虫的致病力具有时效性，具体原因还需进一步研究分析。

环境温度和湿度会直接影响昆虫病原线虫对寄主的致病能力［25］。本文研究得出，环境温度为25 ℃时，斯氏线虫对铜绿丽金龟幼虫致病力最强，在侵染120 h 后，金龟子幼虫的死亡率为96.67%。当土壤湿度为18%时，斯氏线虫对铜绿丽金龟幼虫的致病力最强，在侵染120 h 后，金龟子死亡率为93.33%。谢钦铭等［26］研究表明，大多数昆虫病原线虫在5～10 ℃基本停止活动，25 ℃移动最为活跃，35 ℃以上时，线虫没有致病力。土壤湿度过低或过高不仅影响到线虫的活动，还有可能致使线虫缺氧或脱水死亡，较为适宜的土壤湿度在提高线虫扩散能力的同时增强了其对寄主的侵染能力，丛斌［27］等研究表明适宜线虫的土壤含水量为20%左右，在10%～30%范围内均不影响线虫继续侵染寄主，但长时间浸水和干燥会使线虫死亡。

蛴螬在恩施地区主要危害种类为铜绿丽金龟和暗黑鳃金龟，其中铜绿丽金龟为一年一代危害，暗黑鳃金龟为两年一代危害，考虑到金龟的羽化时间为3 个月，不同金龟的生长、生活周期也有区别。由于本文研究得出斯氏线虫对铜绿丽金龟的致病力强于对暗黑鳃金龟的致病力，因此在田间利用斯氏线虫防治需要确定蛴螬的最佳防治窗口，还需要结合不同金龟子成虫的虫口密度、田间的地温和幼虫虫口密度等，此方面还需进一步调查研究。

4 结论

本文从恩施地区利川市林业局甘溪山银杏GAP基地分离得到斯氏线虫和嗜菌异小杆线虫2 种昆虫病原线虫，以恩施地区主要危害蛴螬种类（铜绿丽金龟和暗黑鳃金龟）为防治对象，经过筛选得出斯氏线虫对本地蛴螬的致病力强于嗜菌异小杆线虫，斯氏线虫对铜绿丽金龟的致病力强于对暗黑鳃金龟的致病力。经室内测定得出，当侵染剂量为300 IJs/mL时，斯氏线虫对铜绿丽金龟幼虫致病力最强；25 ℃条件下，斯氏线虫对铜绿丽金龟幼虫致病力最强；当土壤湿度为18%时，斯氏线虫对铜绿丽金龟幼虫的致病力最强。该研究结果为后续利用斯氏线虫生防制剂防治当地银杏蛴螬提供了理论参考依据。