金银花离体快繁体系的建立

钱晶晶 王宁

(安徽科技学院，安徽 滁州 233100)

引言

金银花(Lonicera japonica Thunb.)为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物，多年生缠绕木本[1]，作为我国历史悠久的中药材[2]，其主要有效成分为绿原酸和类黄酮等[3]，具有清热(尤其儿童退烧)、解毒、抗氧化、增强免疫力[4,5]等功效，巨有极大的市场需求。目前金银花的主要栽培方式为大田种植，而绿原酸等有效物质的提取又需从植物花中提取，费时费力[6]，利用组织培养技术能够建立金银花离体快繁体系，避免时间、空间、气候等条件的限制[7]，提高目标化合物产率，可以更好地控制金银花种苗质量，为金银花药用化学物质的商业化生产打下基础。

本研究以金银花茎段为外植体，建立离体快繁体系，为金银花种苗生产，以及有益物质的简单、快速大规模提取建立基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料来源于安徽科技学院种植园，秋季选取生长健壮、无病虫害、种质优良的金银花嫩枝作为外植体。

1.2 培养条件

培养条件为温度25±2℃，相对湿度保持在70%左右，光照2500lux，光照周期12h·d-1。

1.3 金银花离体快繁体系的建立

1.3.1 外植体接种

选取金银花约1cm嫩枝茎段(带有1个腋芽)，先用清水冲洗，放在超净工作台中，用75%的乙醇浸泡30s，再用无菌水冲洗5遍，用0.1%HgCl2加2滴吐温消毒9min，最后用无菌水冲洗5遍。接种到培养基内，培养35d。

1.3.2 培养基的选择

选取MS、1/2MS、WPM、B5 4种基本培养基，每种培养基内加入3%的蔗糖和0.55%的琼脂，pH调至6.5，加入1.0mg·L-1的6-BA。每种培养基作为一个处理，共4个处理，每组处理共做15个重复。将接种后的金银花放入培养室内，培养35d，观察金银花组培苗增殖及植株生长情况并记录数据，计算出平均增殖量和平均生长量。

平均不定芽增殖量(n)=不定芽增殖总量(n)/接种数(n)×100%

平均生长量(cm)=(生长总长度(cm)-接种长度)/接种数

1.3.3 培养激素的选择

以MS培养基为基本培养基，培养基内加入3%的蔗糖和0.55%的琼脂，pH调至6.5，分别加入0mg·L-1、0.5mg·L-1、1.0mg·L-1、1.5mg·L-1、2.0mg·L-1的6-BA，然后放入高压灭菌锅(美国，致微，GR60DA)内121℃灭菌20min。在超净工作台(中国，苏州净化，SW-CJ-1D/1G)中把金银花茎段接入培养基内，每个茎节上都要保留1～2个腋芽。共5组处理，每组处理做15个重复。培养35d,观察金银花出芽数及不定芽增殖数量并记录数据，计算不定芽诱导率和平均增殖量。

不定芽诱导率(%)=出芽数(n)/接种数(n)×100%

平均增殖量(n)=增殖总量(n)/接种数(n)

以MS培养基为基本培养基，培养基内加入3%的蔗糖和0.55%的琼脂，pH调至6.0±0.2，分别加入0mg·L-1、0.5mg·L-1、1.0mg·L-1、1.5mg·L-1、2.0mg·L-1的IBA，然后放入高压灭菌锅(美国，致微，GR60DA)内121℃灭菌20min。在超净工作台(中国，苏州净化，SW-CJ-1D/1G)中把金银花茎段接入培养基内，每个茎节上都要保留1～2个腋芽。共5组处理，每组处理做15个重复。培养35d，观察生根数量，测量根长并记录数据，计算出生根率和平均根长。

生根率(%)=生根数(n)/接种数(n)×100%

平均根长(cm)=总根长(cm)/生根总数(n)

选用MS培养基为基本培养基，培养基内加入3%的蔗糖和0.55%的琼脂，pH调至6.0～6.5，分别加入NAA浓度0.2mg·L-1、0.4mg·L-1、0.6mg·L-1、0.8mg·L-1、1.0mg·L-1和6-BA浓度为0.2mg·L-1、0.4mg·L-1、0.6mg·L-1、0.8mg·L-1、1.0mg·L-1的激素配比，如表1所示，然后放入高压灭菌锅(美国，致微，GR60DA)内121℃灭菌20min。在超净工作台(中国，苏州净化，SW-CJ-1D/1G)中将金银花的幼叶，切成1cm×1cm的方形，在叶片背面叶脉处用手术刀轻划2个伤口，背面朝下接种到培养基上。共25组处理，每组处理做4个重复。培养21d后，观察愈伤生长情况，统计愈伤诱导数、愈伤质量，计算出愈伤诱导率和增长倍数。

愈伤诱导率=愈伤诱导数/接种数×100%

愈伤诱导平均质量=愈伤诱导总量/接种数

2 结果

2.1 不同培养基对金银花幼苗生长的影响

金银花腋芽经过7d的培养开始生长，茎节开始膨大逐渐增高，10d左右丛生芽开始产生。由图1可以看出，不同类型的培养基诱导幼苗平均增殖量从多至少依次为B5、MS、1/2MS、WPM,诱导幼苗平均伸长量从高至矮依次为MS、1/2MS、WPM、B5。B5培养基其大部分长出来的幼苗茎比较细且植株矮小，叶片黄绿色且蜷缩多，因此B5培养基不利于金银花的生长。MS培养基中金银花长势高、叶片大且颜色翠绿。由此可得，金银花在MS培养基中的长势比在WPM、1/2 MS、B5 3种基础培养基中长势好。

表1 不同浓度激素配比情况

图1 不同类型培养基诱导不定芽的平均增殖量和平均生长量

2.2 不同培养激素对金银花幼苗生长的影响

2.2.1 诱导不定芽生成激素的筛选

从图2可以看出，在同一种基础培养基中加入不同浓度的细胞分裂素(6-BA)，使植株的成长状况产生了很大的变化，细胞分裂素加快了细胞的分化及调节植株的生长。试验结果表明，不定芽诱导率最高的为MS加6-BA 0.5mg·L-1，不定芽率达到93.3%，MS加6-BA 2.0mg·L-1、MS加6-BA 1.5mg·L-1和MS加6-BA 1.0mg·L-1的不定芽诱导率为85%，不加6-BA不定芽的诱导率为0。金银花平均生芽数由多到少的培养基依次为MS加6-BA 2.0mg·L-1、MS加6-BA 1.5mg·L-1、MS加6-BA 0.5mg·L-1、MS加6-BA 1.0mg·L-1。6-BA在一定浓度范围，不定芽的数量随着激素浓度的升高而增加，当6-BA浓度为0.5～1.0mg·L-1时不定芽的诱导量增加，6-BA浓度在1.0～2.0mg·L-1时不定芽的诱导量逐渐减少。因此，诱导不定芽增殖的最佳6-BA浓度为1.0mg·L-1。

图2 不同浓度激素对不定芽诱导率和平均增殖量的影响

2.2.2 生根激素的筛选

图3 不同浓度激素对生根率和平均根长的影响

从图3可以得出,不同浓度的IBA诱导金银花生根的状况不同。试验结果表明，诱导金银花平均生根率最高的培养基为MS加IBA 1.5mg·L-1，生根率达到80%，其次为MS加 IBA 2.0mg·L-1，生根率为53.3%。金银花平均根长从长至短培养基依次为MS加IBA 2.0mg·L-1、MS加IBA 1.5mg·L-1、MS加IBA 1.0mg·L-1、MS加IBA 0.5mg·L-1。虽然MS加IBA 2.0mg·L-1的培养基培养出的金银花根系最长，但根系不够粗壮。生产中所需要的组培苗根系比较健壮、根系较多，这样更有利于植株的成活。综合试验结果得出，筛选出MS加IBA 1.5mg·L-1的培养基更有利于植株生根，并且根系健壮发达，种苗成活率能够大大提高。

3 结论与讨论

组培过程中，由于植物基因型及生长特性不同，对于各种条件的需求存在着很大差异，培养基类型、植物生长调节剂、营养成分等都对植物生长有一定的影响[8]，进行针对性分析研究是非常必要的。本试验通过对金银花组织培养，初步建立了金银花离体快繁及细胞悬浮培养的基本体系。

金银花离体快繁体系的建立，最适金银花生长的基本培养基为MS；不定芽诱导最适培养基为MS加6-BA 1.0mg·L-1；根系生长最适培养基为MS加IBA 1.5mg·L-1。与传统繁殖方式相比，金银花离体快繁体系的建立，提高了金银花的繁殖系数，缩短了培育时间,为其种质资源保存、基因工程育种及推广应用奠定基础，同时也可促进我国优质金银花的培育，为金银花的工厂化快速繁殖优质种苗奠定了基础。