1株产GES-1型碳青霉烯酶铜绿假单胞菌的全基因组测序分析*

郭庆昕，蔡加昌，周宏伟，张嵘，蒋华蔚，胡燕燕(.泉州市正骨医院检验科，福建泉州362000；2.浙江大学医学院附属第二医院 a.检验科，b.血液科，杭州30009)

铜绿假单胞菌是重要的医院感染菌之一，可引起重症肺炎、败血症、烧伤伤口感染等。产碳青霉烯酶铜绿假单胞菌(carbapenem resistantPseudomonasaeruginosa, CRPA)可水解几乎所有可用的β-内酰胺类抗菌药物，对全球公众健康构成了严重威胁[1]。β-内酰胺酶可分A、B和D三大类，A类包括KPC、BEL、CTX-M、GES家族的成员，B类包括NDM、IMP家族和VIM家族，D类主要是OXA家族。GES类型的β-内酰胺酶在20世纪后期被发现，因其含有丝氨酸碳β-内酰胺酶的结构特征(即Cys69和Cys239之间的二硫键)，故与KPC型一起被分在A类中[2]。blaGES基因容易发生突变，目前已鉴定出40个亚型[3]，GES酶水解谱也不断扩大，从原先的超广谱β-内酰胺酶逐渐进化为碳青霉烯酶[4]。为充分阐明耐药菌的传播动态，本研究对1株产GES-1型碳青霉烯酶铜绿假单胞菌进行全基因测序分析，采用生物信息技术分析本菌的多位点序列分型(multisite sequencing typing, MLST)、毒力基因和耐药基因，并分析blaGES-1基因所处的周围环境。

1 材料与方法

1.1研究对象 研究菌株来自浙江大学医学院附属第二医院重症医学科1例重症肺炎患者，该患者住院期间多次发热，曾先后使用哌拉西林钠/他唑巴坦钠、比阿培南、左氧氟沙星等抗感染治疗。该菌株于患者入ICU 13个月后从合格痰标本中分离，经基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱及微量肉汤稀释法确定为CRPA，此后7个月中反复从痰标本中检出。应用哌拉西林/他唑巴坦、比阿培南等抗菌药物治疗，但患者肺炎持续加重，呼吸功能衰竭，最终死亡。

1.2主要仪器与试剂 MALDI-TOF质谱仪(德国Bruker公司)，PCR扩增仪、凝胶成像系统(Bio-Rad公司)，Illumina HiSeq X10测序平台(美国Illumina公司)，3730测序分析仪(美国ABI公司)，电泳仪(北京六一仪器厂)；血琼脂平板(郑州安图生物公司)，铜绿假单胞菌药敏试剂盒(珠海迪尔公司)，引物(上海生工生物公司)，dNTP mix、10×Buffer、Taq酶、加样缓冲液(大连宝生物公司)，细菌全基因组提取试剂盒(广州Magen公司)。

1.3细菌鉴定 标本接种于血琼脂平板培养过夜，分离菌采用MALDI-TOF质谱进行菌种鉴定。

1.4抗菌药物敏感性试验 采用微量肉汤稀释法检测庆大霉素、阿米卡星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、左氧氟沙星、黏菌素、多黏菌素、头孢哌酮/舒巴坦的敏感性，以铜绿假单胞菌ATCC 27853作为质控菌株，结果判读参照据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M100-S28标准[5]。亚胺培南和/或美罗培南的最低抑菌浓度≥8 μg/mL时判定为CRPA，头孢哌酮/舒巴坦敏感性判读参照CLSI-M100-S28中头孢哌酮方案进行。

1.5全基因组测序及分析 使用细菌基因组提取试剂盒提取DNA，用TE缓冲液洗脱，用紫外分光光度计对所提取的DNA进行浓度测定，测定后的合格样品送北京安诺优达基因科技公司，经DNA片段化、末端补平、3′端加A、连接测序接头、PCR扩增与纯化等完成文库制备，然后采用Illumina HiSeq X10测序平台通过双末端150 bp测序读长策略进行高通量测序。原始序列通过SPAdes v3.11.1[6]进行组装，“cov-cutoff”参数选为“auto”，“phred-offset”参数选为“33”，并用RAST[7]和Prokka[8]进行注释，Prokka软件的“kingdom”参数选择“Bacteria”并且选用“metagenome”参数提高基因预测能力。然后，通过Kleborate和ResFinder[9]分析菌株的MLST、毒力基因和耐药基因，参数均采用软件默认的设置(threshold for ID%为90%，minimum length为60%)。该铜绿假单胞菌的全基因测序原始数据已提交NCBI网站(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)，BioProject登记号：PRJNA648026，Biosample登记号：SAMN15616709。

1.6blaGES-1基因环境分析 全基因组测序分析显示blaGES-1基因位于NODE_219片段中，长度3 150 bp，上游为整合子1(intl1)部分序列，下游为插入序列(ISPa21e)的部分序列。为呈现intl1和ISPa21e的完整序列，各设计了3对引物对这2个基因进行PCR扩增，引物序列见表1，产物送上海生工生物工程公司采用3730测序分析仪测序，结果用DNAMAN软件拼接。

表1 intl1和ISPa21e扩增延伸引物

2 结果

2.1抗菌药物敏感性试验 根据CLSI-M100-S28判读标准，该菌对美罗培南、黏菌素和多黏菌素B敏感，对其他抗菌药物均为耐药。见表2。

表2 抗菌药物敏感性试验结果

2.2全基因组测序结果 该菌全基因组测序分析结果显示，测序深度75×，基因组覆盖度100%。

2.2.1MLST及血清分型结果 经全基因组测序对7对管家基因(acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA、trpE)[10]进行分析，经https:∥cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/查询，结果为(38-11-3-13-1-2-4)，经比对，MLST分型为ST235型，血清分型为O11型。

2.2.2耐药基因测序结果 经ResFinder数据库比对，本株分离菌共携带有12个抗菌药物耐药基因，见表3。

表3 耐药基因测序结果

2.2.3blaGES-1基因比对结果及基因环境 全基因组测序分析发现，blaGES-1基因位于长度为3 150 bp的 NODE_219片段中。该基因片段与GenBank中的 KY860573菌株的72068—75217一致率为99.94%。blaGES-1基因上游1—192为整合子1(intl1)部分序列；372—1235为β-内酰胺类耐药基因blaGES-1，长度为864 bp，经ResFinder数据库比对，与登记号为HQ170511的菌株100%一致；下游依次为：1374—1928为氨基糖苷类/氟喹诺酮类耐药基因aac(6′)-Ⅰb3，长度为558 bp；2009—2253为无功能基因gcuE15，长度为245 bp；2261—3055为氨基糖苷类耐药基因aph(3′)-XV，长度为795 bp；3077—3150为插入序列ISPa21e部分序列。采用PCR扩增加测序对整合子intl1和插入序列ISPa21e进一步延伸，intl1全长为1 014 bp，ISPa21e全长为1 297 bp。blaGES-1基因环境见图1。

注：整合子1(intl1)长度1 014 bp，β-内酰胺类耐药基因(blaGES-1 )长度为864 bp，氨基糖苷类/氟喹诺酮类耐药基因[aac(6′)-Ⅰb3]长度为558 bp，无功能基因gcuE15长度为245 bp，氨基糖苷类耐药基因[aph(3′)-XV]长度795 bp，插入序列ISPa21e长度为1 297 bp。

2.2.4毒力基因测序结果 全基因组测序分析共查询到该菌包含有357个毒力基因，其中胞外酶3种，T3SS转录因子5种，胞外多糖20种，外毒素1种，溶血磷脂酶C 3种，溶血磷脂酶D 1种，鞭毛蛋白14种，鞭毛丝蛋白15种，菌毛蛋白25种，主要毒力基因见表4，该菌为exoU+/exoS-基因型。

表4 本菌携带的主要毒力基因

3 讨论

铜绿假单胞菌的碳青霉烯酶编码基因(carbapenemase-encoding genes，CEGs)并非来源于其本身，而是水平基因转移获得的外源基因[11]。尽管其获得性CEGs的起源尚不清楚，但最有可能是来源于具有相同生态位的环境细菌[12]。以往认为GES酶水解碳青霉烯的能力很低，可被碳青霉烯类抗菌药物亚胺培南抑制，但GES酶的独特之处在于能通过单点突变将其水解谱扩展至碳青霉烯类[13]。

综合全球的多项研究，发现ST235、ST175和ST111是CRPA 3个主要的高风险克隆，而ST235分布最广，遍布全球五大洲，且ST235与O11型血清型相关[14]。Mulet等[15]研究了可能导致铜绿假单胞菌高风险克隆成功的生物标记，发现其在运动和产生色素上存在缺陷，但生物膜形成水平和自发突变频率增加，这些特征与高风险克隆引起的慢性感染互相印证。高风险克隆的耐药性与转移耐药和自发突变机制有关，其中ST235型中报道了近100个水平获得耐药元素，绝大多数产生金属β-内酰胺酶或超广谱β-内酰胺酶，其中GES酶最为多样化[16]。

本菌基因环境分析显示，在blaGES-1上游为Ⅰ类整合子(intl1)，下游为耐药基因aac(6′)-Ⅰb3和aph(3′)-XV，右侧翼的插入序列(ISPa21e)。有研究发现CRPA中获得性碳青霉烯酶大多数存在于染色体位置tn402类转座子内的Ⅰ类整合子上[17]。整合子是编码产生整合酶，介导位点特异性重组，负责获得或切除载有抗菌药物耐药基因的基因盒，多个基因片段可能被同一整合子捕获到可变区域[18]，这解释了本菌blaGES-1基因环境中3 150 bp的片段中集聚着3个重要的耐药基因，对β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类等抗假单胞菌抗菌药物耐药的原因。下游为IS110家族中的插入序列ISPa21e，该插入序列属于高度可移动性转座因子，是对基因组一个或多个靶位点具有插入能力的小分子片段，并可以移动邻近的基因[19]。该序列在染色体上的特定位置在不同的ST235分离株之间有所不同，表明在该克隆谱系的进化过程中发生了染色体重排[20]。在医院环境中，非发酵革兰阴性菌是这些元素的主要贮藏库，当转移到铜绿假单胞菌高风险克隆中时，会发生垂直扩增，导致CRPA的发生[21]。

经比对，本菌含有357个毒力基因，这些因子在细菌黏附、运动、生物膜形成、抗菌药物耐药和细胞毒性等不同环节中起作用。Ⅲ型分泌系统(T3SS)在铜绿假单胞菌生物膜形成、细胞毒作用中起重要作用，在感染过程中铜绿假单胞菌将毒素ExoS、ExoT、ExoU、ExoY注入到靶真核细胞的胞浆中，其中ExoU是一种磷脂酶效应细胞毒素，可致呼吸道、尿道、角膜和软组织等急性上皮损伤[22]。大多数铜绿假单胞菌均可检出ExoY和ExoT，而ExoS和ExoU则相对立，exoU-/exoS+基因型通常与侵袭表型相关，会导致宿主细胞的缓慢死亡；exoU+/exoS-基因型与细胞毒性高的菌株相关，导致宿主细胞快速而稳定的裂解，经常与慢性感染相关。高风险克隆ST235均为exoU+/exoS-基因型，与其他克隆相比，其临床效果差，预后不良[23]。ExsA、ExsB、ExsC、ExsD、ExsE特别是ExsA，是T3SS基因表达的主要调控因子，鞭毛丝蛋白(FliC)、胞外多糖(alg)等是T3SS的其他效应子。外毒素、溶血磷脂酶C、D是重要的细胞毒素,也可导致宿主细胞裂解。

临床早期发现高风险克隆对医院感染控制具有重要意义，有助于避免其在医院环境中扩散。全基因组测序在多重耐药菌的医院感染调查中提供基因分型、耐药基因、毒力基因等多种重要信息，在充分阐明耐药菌的传播动态，了解高风险克隆成功的因素等方面发挥重要作用。