网状蛋白1C与Hp阳性肥胖患儿并发非酒精性脂肪性肝病的关系*

白青山， 宋鹏， 于艳， 高慧

(1.唐山市妇幼保健院 消化内科， 河北 唐山 063000；2.唐山市妇幼保健院 儿内科， 河北 唐山 063000； 3.唐山市妇幼保健院 内科， 河北 唐山 063000)

近年来，我国儿童肥胖发病率逐年增加，已成为公共卫生的一大挑战[1]。肥胖与多数疾病密切相关，如肥胖相关肾病、糖尿病及非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)等[2]。幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)感染与肥胖关系密切，二者相互作用可调节胰岛素抵抗、炎症因子、脂质代谢及肠道菌群等参与NAFLD发病及进展[3]。NAFLD是一种以肝脏细胞脂肪变性为特征的临床综合症，若不及时进行干预，极易发展为肝纤维化、肝硬化等[4]，探究Hp阳性肥胖患者并发NAFLD的机制、预判并发NAFLD的生物标志物具有重要意义。网状蛋白1C(reticulin 1C，RTN-1C)是一种主要存在于内质网膜上的网状蛋白，可调节内质网结构和功能[5-6]。有研究报道RTN-1C过表达可激活细胞自噬，干扰其表达则可抑制细胞自噬[7]。脂噬是一种选择性自噬，可选择性识别脂质并将其降解，从而维持细胞正常的脂质稳态，已被证实与肥胖、NAFLD有关[8]，关于RTN-1C与Hp阳性肥胖并发NAFLD关系的研究较缺乏。因此，本研究观察RTN-1C在Hp阳性肥胖患儿外周血单个核细胞中的水平，分析其与并发NAFLD及其严重程度的关系，探究RTN-1C在Hp阳性肥胖并发NAFLD的发生发展中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年1月—2020年5月本院就诊的Hp阳性肥胖患儿作为研究对象，均符合《中国学龄儿童青少年超重、肥胖筛查体质量指数值分类标准》[9]中肥胖诊断标准[体质量指数(body mass index，BMI)高于同年龄、性别的儿童的第95百分位数]并经13C-尿素呼气试验检查确诊为Hp阳性。排除以下情况：应用影响血脂、血糖或肝功能药物；下丘脑、垂体或甲状腺异常引起的肥胖；糖尿病或空腹血糖高于5.6 mmol/L；肝、肾功能异常(NAFLD除外)；伴恶性肿瘤；有饮酒史。纳入Hp阳性肥胖患儿206例，男123例、女83例，年龄7～14岁、中位年龄10岁。参照《儿童非酒精性脂肪肝病诊断与治疗专家共识》[10]诊断NAFLD，根据是否并发NAFLD将206例Hp阳性肥胖患儿分为非NAFLD组(n=63)和NAFLD组(n=143)，2组患儿的基线资料见表1。本研究入组的所有患儿的监护人签署了知情同意书，本研究经唐山市妇幼保健院医学伦理委员会批准(2019-015-001)。

1.2 方法

1.2.1临床资料收集 收集所有患儿年龄、性别、BMI、疾病史、空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、胰岛素(fasting insulin，FINS)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)等资料，同时计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resist，HOMA-IR，计算公式 HOMA-IR=FBG×FINS/22.5)[11]。

1.2.2NAFLD严重程度判定 根据B超结果判断NAFLD组患儿严重程度，包括：(1)肝脏轻中度肿大且边缘角圆钝;(2)肝脏内管道结构不清晰;(3)肝脏内血流信号减弱但血管走向正常;(4)肝区进场回声弥漫性增强、远场回声逐渐减弱；具备任1项定义为轻度，任2项定义为中度，具备任2项且肝右叶包膜和横膈回声显示不清或不完整定义为重度[12]。

1.2.3外周血单个核细胞中RTN-1C水平检测 采用Ficoll密度梯度离心法[13]分离外周血中单个核细胞。患儿肝脏B超检查当日抽取空腹肘部静脉血10 mL，磷酸盐缓冲溶液稀释，置于Ficoll分离液中低温环境下2 000 r/min 离心20 min，吸取外周血单个核细胞层，用磷酸盐缓冲溶液重悬细胞，1 500 r/min离心10 min，重复上述操作2次，吸取单个核细胞。用蛋白质免疫印迹法[14]检测单个核细胞中RTN-1C水平：用放射免疫沉淀(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解缓冲液裂解单个核细胞，获取总蛋白，用二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒定量；用10%SDS-PAGE分离胶电泳，120 V至溴酚蓝跑出胶面，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h；兔抗人RTN-1C单克隆抗体(1 ∶1 000，武汉维克赛斯科技有限公司，批号07521)4 ℃孵育过夜，山羊抗兔二抗(1 ∶5 000，北京百奥莱博科技有限公司，批号0590)室温下孵育1 h；用化学底物发光液曝光显影，用Image J软件读取实验结果。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 基线资料

2组Hp阳性肥胖患儿在年龄、性别、BMI、TG和HDL-C水平方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。NAFLD组FBG、FINS、HOMA-IR、TC、LDL-C、ALT及AST水平均高于非NAFLD组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 非NAFLD组和NAFLD组Hp阳性患儿基线资料的比较

2.2 RTN-1C水平

NAFLD组Hp阳性患儿外周血RTN-1C水平低于非NAFLD组，差异有统计学意义(t=13.984，P<0.001)。见图1。

注：A为蛋白质免疫印迹法检测结果，B为外周血RTN-1C水平定量结果；(1)与非NAFLD组比较，P<0.001。

2.3 Hp阳性肥胖患儿并发NAFLD的相关因素分析

应用lasso回归筛选自变量，选取λ最小值时，进入模型的自变量有BMI、FBG、TC、LDL-C、ALT及RTN-1C；将Hp阳性肥胖患儿是否并发NAFLD作为因变量，BMI、FBG、TC、LDL-C、ALT及RTN-1C作为自变量纳入多因素Logistic回归分析。结果显示FBG、TC、LDL-C及ALT是Hp阳性肥胖患儿并发NAFLD的独立危险因素(P<0.05)，RTN-1C是Hp阳性肥胖患儿并发NAFLD的独立保护因素(P<0.05)。见表2。

表2 Hp阳性肥胖患儿并发NAFLD的Logistic回归分析

2.4 RTN-1C与Hp阳性肥胖患儿并发NAFLD的关系

RTN-1C诊断Hp阳性肥胖患儿并发NAFLD的ROC曲线下面积、最佳截断点、敏感度和特异度分别为0.923(95%CI为0.878～0.956)、0.86、77.62%和96.83%(图2)。用限制性立方样条拟合Logistic回归分析RTN-1C与Hp阳性肥胖患儿并发NAFLD的关系，当节点个数为3时，AIC值最小(AIC=134.278)，分析结果显示RTN-1C与Hp阳性肥胖患儿并发NAFLD有关(χ2=46.69，P<0.001)，且呈线性关系(非线性检验χ2=2.65，P=0.103)。以RTN-1C诊断Hp阳性肥胖患儿并发NAFLD的最佳截断点做为参考点，当RTN-1C<0.86时，并发NAFLD风险增加；当RTN-1C>0.86时，并发NAFLD风险降低(图3)。

图2 RTN-1C诊断Hp阳性肥胖患儿并发NAFLD的ROC曲线

图3 RTN-1C与Hp阳性肥胖患儿并发NAFLD的限制性立方样条图

2.5 RTN-1C与NAFLD严重程度的关系

轻度(n=62)、中度(n=50)和重度(n=31)NAFLD患儿RTN-1C水平分别为(0.89±0.11)、(0.80±0.08)和(0.71±0.07)，3组比较差异有统计学意义(F=44.745，P<0.001)。轻度NAFLD患儿RTN-1C水平分别高于中度和重度NAFLD患儿，差异均有统计学意义(q=7.289、13.162，P<0.01)；中度NAFLD患儿RTN-1C水平高于重度NAFLD患儿，差异有统计学意义(q=6.604，P<0.01)；NAFLD患儿RTN-1C水平与NAFLD严重程度呈负相关关系(r=-0.671，P<0.001)。

3 讨论

长期Hp感染会导致胰岛素抵抗及炎症反应，易诱发肥胖和NAFLD[15]。此外，肥胖患者多伴有胰岛素抵抗、游离脂肪酸增多、炎症因子及脂肪细胞因子代谢紊乱等，上述因素均在NAFLD发生、发展过程中发挥着重要作用[16]。因此，Hp阳性肥胖患儿更易并发NAFLD。外周血单个核细胞中相关蛋白或基因与肝脏疾病密切相关，可在一定程度上反映肝脏的脂肪变性、炎症等程度[17-18]。本研究通过比较非NAFLD组和NAFLD组Hp阳性肥胖患儿外周血单个核细胞中的RTN-1C水平，结果显示NAFLD组Hp阳性肥胖患儿RTN-1C水平低于非NAFLD组，该结果提示RTN-1C或许与Hp阳性肥胖并发NAFLD有关。

既往研究表明FBG、TC、LDL-C及ALT均是NAFLD发病的独立危险因素[19-24]。为避免混杂因素影响，本研究对血糖水平做了一定限制，未将糖尿病或空腹血糖高于5.6 mmol/L的患儿纳入研究，以避免上述因素影响本研究分析结果。采用多因素Logistic回归分析影响Hp阳性肥胖患儿并发NAFLD的相关因素，结果显示FBG、TC、LDL-C及ALT是Hp阳性肥胖患儿并发NAFLD的独立危险因素，与上述文献结果一致。本研究结果还显示RTN-1C是Hp阳性肥胖患儿并发NAFLD的独立保护因素。此外，限制性立方样条拟合多因素Logistic回归分析结果还显示当RTN-1C<0.86时，并发NAFLD风险增加；当RTN-1C>0.86时，并发NAFLD风险降低。RTN-1C在细胞自噬调节中起着关键作用，其不仅可调节自噬体积累，还可调节LC3水平，促进自噬小体形成[25]。此外，RTN-1C还可靶向内质网应激通路调节线粒体形态及活性，促进线粒体相关内质网膜形成，加速线粒体和内质网之间的脂质交换[7]。推测RTN-1C表达水平高，更能激活细胞脂噬，从而将细胞内多余脂质降解，维护细胞的脂质稳态，外周血单个核细胞中RTN-1C表达水平可反映脂噬程度，进而反映肝脏内脂肪变性程度。

本研究比较了轻、中、重度NAFLD患儿外周血单个核细胞中RTN-1C表达水平，结果显示随NAFLD病情加重，外周血单个核细胞中RTN-1C表达水平逐渐降低，且与NAFLD严重程度呈负相关关系，上述结果均表明RTN-1C与NAFLD进展有关，但关于其病理生理机制仍需开展基础研究进一步证实。

综上所述，RTN-1C与Hp阳性肥胖患儿并发NAFLD有关，检测其水平有利于判断NAFLD发病情况，RTN-1C表达水平低提示并发NAFLD风险较高，RTN-1C与NAFLD严重程度呈负相关关系。本研究上存在一定不足，一是纳入研究样本量偏小，且为单中心研究；二是在样本选取上存在一定偏倚，上述不足均可能影响分析结果，因此下一步将开展大样本、多中心研究以弥补上述不足。