不同施肥处理对当归药材质量的影响

彭桐 王引权 李钦 荔淑楠 魏丽娟 党昇荣

摘要：以不施肥为对照，探究单施有机肥、施用生物有机肥加复合肥、单施复合肥，研究不同施肥处理对当归药材质量的影响，为当归栽培的合理施肥提供理论依据。参照2020年版《中华人民共和国药典》中四部方法測定当归水分、总灰分、酸不溶性灰分和醇溶性浸出物含量，采用甲苯法测定当归中多糖含量;采用高效液相色谱法（HPLC）测定当归中阿魏酸、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯I等7种化学成分的含量。结果表明，单施有机肥可显著降低当归药材的水分含量，提高浸出物含量;生物有机肥+复合肥处理可降低总灰分和酸不溶性灰分含量并提高浸出物含量;4种施肥处理之间当归多糖含量并无显著性差异;根据主成分分析结果，单施复合肥和单施有机肥可促进当归中7种主要药效成分含量的提高。综合来看，本研究中当归的最佳施肥条件为单施有机肥4 797.6 kg/hm2。

关键词：施肥;当归;质量;HPLC;主成分分析

中图分类号： S567.23+9.06  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2021）10-0126-06

当归为伞形科植物当归[Angelica sinensis （Oliv.） Diels.]的干燥根，有补血活血，调经止痛和润肠通便的功效[1]。目前临床上使用的当归药材多为栽培品，甘肃省定西市岷县、漳县、陇南市宕昌县等地为当归药材的道地产区[2]，占全国市场流通量的70% 以上[3]。目前，在当归种植过程中由于连作和大量施用化肥，造成土壤板结、土壤质量下降，土壤特性不稳定等问题，从而影响了当归品质。有研究证实恰当施肥不仅能促进当归的生长发育，提高药材产量，还可改善药材品质[4]。鉴于此，笔者所在课题组研究设计了单施有机肥、单施复合肥、有机肥与复合肥配施3种施肥方式，以不施肥为对照，对当归药材的质量影响进行试验研究。本研究以当归药材中当归多糖的含量和有机酚酸类（阿魏酸、阿魏酸松柏酯）跟苯酞类（洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A、藁本内酯、欧当归内酯）7种化学成分的含量[5-6]作为评价指标。同时结合当归的水分、总灰分、酸不溶性灰分和醇溶性浸出物的含量对当归药材质量进行综合分析比较，为确定最佳施肥方案提供科学依据。以期为当归的生态化种植及质量控制提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

本试验于2019年4—11月在甘肃省定西市岷县蒲麻镇包家沟村进行，海拔约2 600 m，二阴区坡地，地块较平坦，前茬为燕麦。试验地于4月中旬移栽当归前翻地。翻地后，抢墒覆膜，膜宽0.6 m，垄间距30 cm。并按地块条件划定小区。

1.2 试验样品

供试当归种苗选用2018年合作社繁育的当归苗，移栽时按DB62/T 2549―2014《中药材种苗 当归》标准挑选一级苗（茎粗3～5 mm，试验随机取10株当归苗进行苗长、苗鲜质量、茎基直径、分叉数测定）。挑选好的当归苗用甘肃省科学院开发的微生物菌剂浸苗15 min，晾干种苗表皮水分后移栽。供试肥料信息见表1。

1.3 仪器及试剂

高效液相色谱仪（型号：Agilent1200，美国安捷伦公司）;电子分析天平（型号：BT125D，赛多利斯科学仪器北京有限公司）;超纯水系统（型号：Smart-N15VF，上海力康医疗设备有限公司）。

乙腈（天津市大茂化学试剂厂，批号20180618，色谱纯），甲醇（天津市大茂化学试剂厂，批号20160307，色谱纯），冰乙酸（天津市大茂化学试剂厂，批号20170205，色谱纯）。对照品溶液均购于上海源叶生物科技有限公司，具体有阿魏酸对照品（批号H27J7L16718）、洋川芎内酯I对照品（批号P02F9F54166）、洋川芎内酯H对照品（批号P02F9F54165）、洋川芎内酯A对照品（批号P23A9F68613）、正丁基苯酞对照品（批号S09J9D65229）、Z型藁本内酯对照品（批号Y17S9L70462）、欧当归内酯对照品（批号P24A9S68617）、阿魏酸松柏酯对照品（批号Z24D9B78131）。

1.4 试验设计

试验采用单因素随机区组设计，3次重复，每小区面积为2.4 m×12.5 m=30 m2。总占地400 m2。试验共设4个处理，处理1：单施有机肥4 797.6 kg/hm2;处理2：生物有机肥1 799.1 kg/hm2+复合肥 1 199.4 kg/hm2;处理3：单施复合肥7 496.3 kg/hm2;处理4：不施肥（CK）。各处理小区均在播种前施肥，生育期间不施肥。

1.5 试验方法

1.5.1 常规指标测定方法 参照2020年版《中华人民共和国药典》四部方法中的通则0832第四法测定当归药材水分、通则2302测定总灰分和酸不溶性灰分含量和通则2201测定醇溶性浸出物含量。

1.5.2 多糖含量的测定 （1）对照品储备液的制备。将葡萄糖对照品于105 ℃下烘干至完全失去水分，精密称取干燥恒质量后的葡萄糖对照品5.3 mg放入50 mL容量瓶中，加水摇匀定容，得葡萄糖对照品储备液。（2）供试品溶液的制备。称取过60目筛后的当归样品粉末约1 g，加入80%乙醇 100 mL 后加热回流1 h，过滤得滤渣加100 mL蒸馏水加热回流2 h，滤液浓缩后加80%乙醇沉淀，静置过夜后离心，沉淀用温水溶解后定容至100 mL容量瓶，精密量取上述溶液1 mL定容于25 mL量瓶中得供试品溶液。于干燥具塞试管中，依次加入供试品溶液1.0 mL，1.0 mL蒸馏水，2.0 mL 5%苯酚溶液，7.0 mL 浓硫酸，混匀后沸水浴加热20 min进行显色。显色后的溶液需自来水水浴冷却5 min后再测定其吸光度。

1.5.3 高效液相色谱法（HPLC）测定当归中7种化学成分的含量 （1）色谱条件。Merk RP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为1%乙酸（A）：乙腈（B），梯度洗脱：（0～20 min，19%B;20～60 min，19%～95%B;60～75 min，95%～100%B）;检测波长260、280、300 nm;流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;进样量 20 μL。在该色谱条件下，选择波长为280 nm时色谱峰峰形与分离度良好。（2）对照品溶液的制备。精密称取阿魏酸对照品0.006 45 g，阿魏酸松柏酯0.003 01 g，洋川芎内酯I 0.000 75 g，洋川芎内酯H 0.000 72 g，洋川芎内酯A 0.004 23 g，欧当归内酯0.000 96 g，分别加甲醇定容于5 mL容量瓶中作储备液，称取藁本内酯0.005 43 mg，定容至加甲醇 1 mL 容量瓶内，作为储备液。精密移取洋川芎内酯H储备液0.3 mL，欧当归内酯0.2 mL，藁本内酯储备液1 mL，其余各储备液分别移取 0.5 mL 于同一容量瓶，定容至5 mL容量瓶内得混合对照品溶液，对照品溶液在注入液相色谱仪前需经0.22 μm微孔滤膜过滤。绘制标准曲线，见图1。（3）供试品溶液的制备。精密称取过2号筛后的当归药材粉末0.500 g于150 mL锥形瓶中，加入70%甲醇 20 mL 后称质量，将锥形瓶口密封后置于超声仪器内，在220 W，80 Hz条件下超声40 min，取出后冷却并称质量，70%甲醇补足质量，抽取混匀溶液后用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得到供试品溶液。供试品溶液需在4 ℃冰箱内储藏。

1.6 统计方法

使用 Excel 2013 软件进行数据的初步换算和处理，试验数据采用 SPSS 21. 0软件进行主成分分析、显著性检验（P<0. 05）和Duncans多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理的当归药材水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量测定分析

从表2可以看出，各施肥处理下当归药材的水分均小于15.0%，总灰分含量小于7.0%，酸不溶性灰分含量小于2.0%，浸出物含量均超过45.0%，均达到2020年版《中华人民共和国药典》标准。单施有机肥可显著降低药材水分含量，提高浸出物含量，该处理下药材总灰分和酸不溶性灰分含量较高。生物有机肥+复合肥处理下与不施肥相比，总灰分和酸不溶性灰分含量分别降低了9.47%、35.46%。

2.2 多糖含量测定分析

2.2.1 标准曲线的制备 移取葡萄糖对照品储备液0.2、0.4、0.6、0.7、0.8 mL，分别置于10 mL试管中进行显色，待冷却后在490 nm下测定其吸光度[7]，以空白溶液为对照。以吸光度（Y）对葡萄糖溶液浓度（X）进行线性回归，得回归方程Y=68.461X+0.025 3（R2=0.9994），线性范围为2.12～8.48 mg/L。

2.2.2 稳定性试验 按“1.5.2”节供试品溶液的制备方法制备处理1当归样品进行显色后，分别在 0、10、20、30、40、50、60 min测定吸光度，测定结果RSD为3.1%，说明供试品溶液在1 h内稳定。

2.2.3 重复性试验 取过筛后处理1当归样品共6份，按“1.5.2”节供试品溶液的制备方法制备供试液，显色后测定吸光度。测定结果RSD为4.5%，说明重复性良好。

2.2.4 精密度试验 吸取“1.5.2”节对照品溶液0.6 mL并显色，依法连续测定6次吸光度，当归多糖吸光度的RSD为 0.8%，表明精密度良好。

2.2.5 回收率试验 取处理1的当归样品粉末共9份，每份称定约1 g，分为3组，各组分别加入葡萄糖对照品5.0、8.0、10.0 mg，进行测定，得当归多糖的平均回收率分别为98.37%、96.02%、98.97%，RSD为1.72%。

2.2.6 样品测定 取各当归样品，制备供试品溶液并测定，结果见表3。

由表3可知，不同施肥处理下当归多糖含量为处理2>处理4>处理1>处理3。处理2比不施肥当归多糖含量增加了5.62%，但各处理间没有显著性差异。

2.3 HPLC测定当归中7种化学成分的含量

2.3.1 线性关系考察 吸取“1.5.3”节混合对照品溶液，按照一定浓度梯度稀释成6个不同浓度的混合标准品溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后按照“1.5.3”节色谱条件进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），对照品进样浓度为横坐标（X）进行线性回归分析，回归方程及线性范围结果见表4。

2.3.2 重复性试验 称取6份处理1的当归粉末，每份0.5 g，按照“1.5.3”节方法制备供试品溶液，并在色谱条件下进行测定，计算其峰面积，结果按照出峰时间先后顺序阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、藁本内酯、欧当归内酯含量的RSD（n=6）依次为3.45%、3.24%、4.64%、0.62%、3.32%、3.83%、1.09%。RSD值均小于5%。说明本方法重复性良好。

2.3.3 精密度试验 取一份混合对照品溶液，按照“1.5.3”节的色谱条件，连续不间断进样测定6次，考察仪器精密度。结果阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、藁本内酯、欧当归内酯的精密度RSD（n=6）分别为4.09%、1.06%、3.70%、1.82%、0.54%、0.47%、0.55%。RSD值均小于5%。说明该仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 吸取“1.5.3”节下混合对照品溶液，按照色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h测定，记录各成分峰面积。各成分峰面积RSD（n=6）值分别为4.97%、2.93%、0.70%、0.16%、1.17%、0.09%、2.06%。RSD值均小于5%。說明该供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率测定 称取已知含量的6份当归粉末0.5 g，分别加入一定量的阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、藁本内酯、欧当归内酯。按“1.5.3”节方法制备供试品溶液，按照色谱条件测定，计算出7种化学成分的加样回收率，分别是97.49%、100.31%、101.57%、98.27%、101.66%、97.01%和97.45%。RSD分别是3.77%、1.28%、0.65%、1.81%、0.32%、0.48%和0.39%，说明该测定方法的准确性较好。

2.3.6 样品测定 由表5和图2可知，不同施肥处理对当归中7种药效成分含量均有显著影响，单施有机肥有助于当归中阿魏酸和藁本内酯的积累，生物有机肥+复合肥处理下当归中阿魏酸的含量较不施肥处理增加了98.3%。与单施有机肥、生物有机肥+复合肥相比，单施复合肥对当归中洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯和欧当归内酯的积累有促进作用。

2.3.7 主成分分析 （1）相关性分析。运用 SPSS 21.0 统计分析软件，对4个不同施肥处理当归药材中7种化学成分进行主成分分析，结果见表6、表7。提取标准为特征值大于1，前2个成分的累积方差贡献率达到 95.446%，前2个成分可以代表当归药材中的绝大部分信息。根据表7，第1主成分的信息主要由欧当归内酯、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯和洋川芎内酯I组成，第2主成分主要由阿魏酸、洋川芎内酯A和藁本内酯组成。（2）不同施肥处理的当归药材有效成分含量的综合评价。根据表8得到因子得分表达式：W1=-0.173X阿魏酸+0.168X洋川芎内酯I+0.175X洋川芎内酯H+0.168X阿魏酸松柏酯+0.155X洋川芎内酯A-0.070X藁本内酯+0.175X欧当归内酯;W2=0.030X阿魏酸-0.217X洋川芎内酯I+0.093X洋川芎内酯H+0.118X阿魏酸松柏酯+0.330X洋川芎内酯A+0.889X藁本内酯+0.093X欧当归内酯。

式中：X为各成分的含量，方差贡献率为权重。以2个主成分对当归药材进行综合评价，计算其综合评价的函数为W=80.851F1+14.595F2，并对结果进行排序，综合得分排序结果见表9。从当归药效成分积累角度看，单施复合肥的当归质量最好，其次为单施有机肥。不施肥和有机肥+复合肥质量排名靠后。

3 结论与讨论

3.1 不同施肥处理对当归药材水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量的影响

从表2可以看出，各施肥处理下当归药材的水分均小于15.0%，总灰分小于7.0%，酸不溶性灰分小于2.0%，浸出物含量均超过45.0%，均达到2020年版《中华人民共和国药典》标准。中药材中含水量过高会容易出现虫害、霉变、潮解、走味等变质现象，直接影响药材的质量。本试验结果表明，当归水分含量在处理1显著低于其他处理。从药材中的灰分含量可以直观地看出药材的纯度，药材生长环境、种植方式等会影响药材灰分变化，本研究不同施肥处理下药材总灰分含量均为处理2显著低于其他处理，酸不溶性灰分含量也是处理2最低。研究证明，药材中醇溶性浸出物含量和药效成分含量具有一定的正相关性，浸出物可反映药材的内在品质，在处理1和处理2下浸出物含量高于其他处理。由此说明，增施有机肥可降低药材水分、灰分、酸不溶性灰分含量，提高醇溶性浸出物含量。

3.2 不同施肥处理对当归多糖含量的影响

当归多糖具有造血、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫能力等丰富的生理功效[8]。本试验结果表明，不同施肥处理下当归多糖含量大小为处理2>处理4>处理1>处理3。但各处理之间当归多糖含量并无显著性差异。

3.3 利用主成分分析法评价不同施肥处理对当归中7种化学成分含量的影响

据研究，阿魏酸、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯类化合物、藁本内酯和欧当归内酯在诸多方面均具有良好的药理活性[9-11]。阿魏酸是2020 年版《中华人民共和国药典》中当归的指标性成分。故本研究采用HPLC同时测定当归中阿魏酸、洋川芎内酯 I、洋川芎内酯 H、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、藁本内酯和欧当归内酯 7 种成分。以往的研究学者在中药质量评价时大多对指标进行逐一分析，各指标权重和成分之间的联系并不明确，而主成分分析法恰好可以弥补上述问题[12]。主成分分析结果表明，从7种有效成分含量的角度看，单施复合肥和单施有机肥可促进当归有效成分的提高。因为复合肥中的总养分较高（≥51%）且施用量较大，所以可提高当归中药效成分含量。若长期大量施用化肥，必然会造成土壤的肥力减弱，地力下降，土壤的理化性质退化，以及会导致土壤盐渍化、病虫害发生严重等一些其他问题的出现。施用有机肥可使土壤养分含量更全面，肥效更稳定和持久，对有效成分含量积累也有一定的促进作用。

综上所述，不同施肥处理对当归药材品质均有一定影响。本研究中，当归的最佳施肥条件为单施有机肥4797.6 kg/hm2，由于不同施肥处理对当归中不同药效成分的积累能产生不同影响，市面上常见以阿魏酸、藁本内酯或洋川芎内酯为主要成分的各类药物、护肤品等，可针对不同需求结合本研究结果按需施肥。

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