国产新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒的性能比较

孙 莉，朱晋升，代蕾颖，宋 伟，杨 忠，王会如

（北京市医疗器械检验所，国家药品监督管理局体外诊断试剂质量评价重点实验室，北京101111）

0 引言

新型冠状病毒肺炎(以下简称“新冠肺炎”)疫情自发生以来在全国迅速蔓延，严重威胁人民的生命安全和身体健康[1-2]。面对新冠肺炎疫情，只有做到早发现、早诊断、早治疗，才能进一步控制疾病的传播。目前，临床诊断新冠肺炎主要采用病毒核酸检测[3]，但由于该方法受到操作环境、仪器设备和操作人员等因素的限制，血清学检测越来越引起人们的重视。目前，基于抗体的诊断指标已经被归入《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第7版)》，以实现对核酸检测的有效补充，这大大提升了新冠肺炎早期确诊的准确率，可为后期临床治疗进行辅助判定。截至2020年7月，在国家药品监督管理局网站可查到的取得注册证的新型冠状病毒(以下简称“新冠病毒”)检测试剂盒为44种，其中抗体检测试剂盒21种，占47．7%；核酸检测试剂盒23种，占52．3%；新冠病毒免疫类试剂盒中胶体金法抗体检测试剂盒取得注册证的为7种，占15．9%；无抗原检测试剂盒获批。胶体金法抗体检测试剂盒凭借其耗时较短、成本低、不易受到环境限制且操作简便快捷等优点在此次疫情防控中发挥了重要作用，但特异性差、阳性检出率低、阴性样本易出现假阳性结果、检出限高是这类试剂盒的主要问题。本研究选择具有代表性的6种国产IgG抗体检测试剂盒(胶体金法)，测试15例阳性样本，比较其阳性符合率，并通过20例阴性样本和国家标准物质来比较试剂盒阴性符合率和检出限。

1 材料与方法

1.1 样本及标准物质

根据国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第七版)》中确诊病例判断标准，选择感染1周后的阳性灭活样本15例以及同期健康体检者阴性灭活血清样本20例。

采用新冠病毒刺突糖蛋白(S蛋白)人源IgG单克隆抗体溶液标准物质，标准物质编号：GBW(E)091109。使用标准物质说明书中推荐的0．01 mol/L磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)(pH=7．4)将标准物质分别按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶12、1∶16的比例稀释，加上原倍液，共6个水平。本研究采用的标准物质是以新冠病毒重组刺突糖蛋白(S蛋白)为免疫原筛选出的IgG单克隆抗体进行人源化改造的模拟人血清。而6种试剂盒均为定性检测，未规定检出限。因此用不同梯度稀释国家标准物质测试检出限时，不对具体浓度进行关注，只横向比较稀释度。

1.2 试剂及仪器

新冠病毒IgG抗体检测试剂盒分别来自于A、B、C、D、E、F 6个国内生产厂家。检测原理：在胶体金试条的检测线位置包被重组新冠病毒抗原(S蛋白)，当样本中含有新冠病毒IgG抗体时，检测线处的抗原与其结合，同时，该抗体与被胶体金标记的鼠抗人IgG单克隆抗体结合，则在检测线处形成肉眼可见的条带。当质控线处和检测线处均显示条带时，则判为阳性；当质控线处显示条带，而检测线处无条带时，则判为阴性。

所需仪器和设备为生物安全柜[力新仪器(上海)有限公司，型号为HFsafe-1500]、移液器(德国Eppendorf公司，规格为2～20μL)。

1.3 方法

1.3.1 试剂盒检测方法

应严格按照试剂盒说明书的要求操作，注意说明书中对环境条件的要求。具体操作过程见表1，6个生产厂家说明书中对检测条件的要求基本相同，其中有1个厂家没有明确上样量。

表1 试剂盒检测方法说明

1.3.2 阳性符合率

按照试剂盒说明书进行操作，分别取6种检测试剂盒测试15例灭活的临床阳性样本，每个样本检测1次。

1.3.3 阴性符合率

按照试剂盒说明书进行操作，分别取6种检测试剂盒测试20例灭活的临床阴性样本，每个样本检测1次。

1.3.4 检出限

按照试剂盒说明书进行操作，分别取6种检测试剂盒测试国家标准物质稀释液，每个水平检测3次，共6个水平。

1.4 数据分析

计算试剂盒的阳性符合率和阴性符合率，对照检出限结果，比较6种试剂盒之间的差异。

2 结果

2.1 阳性符合率

分别对确诊的15例新冠肺炎临床阳性样本进行检测，计算每种试剂盒的阳性符合率。结果显示，阳性符合率在90．0%～100．0%的有3种，80．0%～＜90．0%的有1种，70．0%～＜80．0%的有2种；其中，试剂盒D的阳性符合率最好，为100．0%，试剂盒C和E的阳性符合率均为93．3．%，试剂盒A的阳性符合率为80．0%，试剂盒B和F的阳性符合率最差，均为73．3%，详见表2。

表2 新冠病毒IgG抗体检测试剂盒阳性符合率结果比较

2.2 阴性符合率

分别对20例临床阴性样本进行检测，计算每种试剂盒的阴性符合率。结果显示，6种试剂盒的阴性符合率均为100．0%，详见表3。

表3 新冠病毒IgG抗体检测试剂盒阴性符合率结果比较

2.3 检出限

采用6种试剂盒测试国家标准物质稀释成的不同梯度溶液，结果为在稀释比1∶16水平检出的试剂盒有1种，在1∶12水平检出的有2种，在1∶8水平检出的有3种，在1∶4和1∶2水平检出的均有5种，原倍6种试剂盒均检出。其中，试剂盒D的检出限最低，试剂盒A、C、E的检出限水平居中，试剂盒F的检出限最高，6种试剂盒的检出限呈梯度分布，详见表4。

表4 新冠病毒IgG抗体检测试剂盒检出限结果比较

3 讨论

在新冠肺炎疫情期间，虽然核酸检测在临床诊断中作为“金标准”存在，但新冠病毒感染患者主要表现为下呼吸道感染，且治疗后体内病毒含量逐渐降低，核酸检测受样本采样部位和时间的影响易产生假阴性结果。在核酸检测前需对样本进行病毒灭活处理，也有研究表明，病毒灭活过程对于病毒含量较高的样本检出率无明显影响，但可能会导致病毒含量较低样本的检出率下降，从而产生假阴性结果[4]。目前已有回顾性研究表明，高度疑似新冠病毒感染患者的病毒核酸阳性检出率仅为30%～50%[5]。另外，核酸检测对仪器设备、检测场地和环境条件以及操作人员的要求较高，存在检测时间长、通量低等缺点。而胶体金法抗体检测试剂盒的优势在于采集样本容易、单个样本即可测试、测试时间短、成本低、样本处理和实验操作简单，非常适合基层大批量样本的现场筛查[6-8]。因此，将胶体法抗体检测试剂盒检测和核酸检测结合使用并联合咽拭子、粪便和血液等多种样本进行检测诊断，对缩短检测窗口期、尽早控制疫情发展非常重要[9]。

鉴于新冠病毒传染性较强，早发现、早报告、早隔离、早治疗对于疾病防控的意义重大[10]。而胶体金法抗体检测试剂盒的检出限与其在低值样本中检出阳性的能力有关，检出限低的试剂盒漏诊率也低[11]。因此，除了阳性符合率和阴性符合率以外，检出限也是评价新冠病毒检测试剂盒的重要指标。当然，这里需要明确的是，试剂盒的检出限指的是由给定测量程序得到的测量值，对于此值，在给定声称物质中存在某成分的误判概率为α时，声称不存在该成分的误判概率为β[12]，与临床的“真阳”不尽相同。

目前，新冠病毒抗体检测试剂盒分为刺突糖蛋白S或核衣壳蛋白N作为包被抗原。S蛋白是病毒感染人体细胞的武器，SARS冠状病毒和新冠病毒都是通过S蛋白结合呼吸道上皮细胞的血管紧张素转化酶2，从而侵入肺组织，导致肺炎[13]。新冠病毒N蛋白与SARS冠状病毒N蛋白具有高度同源性[14]，N蛋白是冠状病毒中产生最早且含量较多的蛋白质，具有很强的免疫原性和特异性，是抗体诊断材料的首选。但是N蛋白抗体基本上在发病10 d才开始大量产生，有研究认为N蛋白抗体作为早期诊断指标可能存在一定的不足[15-16]。因此，市面上绝大多数抗体检测试剂盒选择重组S蛋白包被检测线。本研究选择的6种国产试剂盒均为抗新冠病毒S蛋白IgG抗体检测试剂盒。

通过研究结果可知：(1)试剂盒A和B的检出限较低，但阳性符合率分别为80．0%和73．3%，不及检出限居中的试剂盒C和E(阳性符合率均为93．3%)。考虑以下几方面原因：①选择的国家标准物质是以新冠病毒重组刺突糖蛋白(S蛋白)为免疫原筛选出的IgG单克隆抗体进行人源化改造的模拟人血清，当试剂盒选择的特异性识别位点以及肽段长度接近于国家标准物质时，则检出限低；②有研究表明，重组蛋白诱导的免疫效率较低，可能与免疫途径相关[17-18]。同时，选择的蛋白表达系统不同，也会影响试剂盒的阴性符合率、阳性符合率和检出限[19-20]。③定性试剂盒的说明书中对检验方法的操作描述并不规范，比如，虽然样本稀释液都是2滴，但实际这6家生产厂家对2滴样本稀释液的具体体积解释最低的约为60μL，最高的约为100μL，跨度较大，对检出限的检测结果也有影响。

(2)试剂盒D的检出限最低，且阳性符合率为100．0%，阴性符合率也为100．0%。试剂盒D为多点抓取，多种重组蛋白嵌合抗原覆盖的抗原表位比单一重组蛋白要多得多[21-22]，而检出限最高且阳性符合率为73．3%的试剂盒F则为两点识别。因此，试剂盒D检测临床样本的阳性符合率和阴性符合率都更好。

(3)试剂盒F的检出限最高，且阳性符合率为73．3%，阴性符合率为100．0%，与其他试剂盒相比差异较大。分析除了上面提及的特异性识别位点不同、蛋白表达系统不同、样品稀释液的量值解释不同以外，上样量也是影响检出限检测结果的一个原因。有研究表明，上样量、样品稀释液、反应时间和检测环境均会对胶体金法检测试剂盒的检测结果产生影响[23-24]。试剂盒F说明书中关于上样量的描述是“吸管1滴”，不同操作者及手法、不同环境条件都会对上样量产生影响，从而影响检测结果。

综上所述，对胶体金试条而言，样本经过试条的时间长短、操作环境以及标记抗体的纯度都会影响金颗粒的聚集以及非特异性结合，进而影响结果判定[25]。为了提高国产新冠病毒抗体检测试剂盒的性能，建议生产厂家从以下几方面优化产品：(1)加大研发投入，优化生产工艺，生产厂家可以同步采用原核和真核表达系统进行新冠肺炎多种病毒蛋白表达，并针对多种蛋白质特异多肽片段进行融合表达，优化组合，筛选出具有较强免疫原性和特异性的蛋白质或设计蛋白联合检测，以提高试剂盒的阳性符合率、阴性符合率和检出限；(2)做好供应商评价，严格把握出厂检验，生产厂家内部质控盘的设定应尽量贴近临床实际使用情况；(3)通过规范说明书中对操作方法和环境要求的描述来提高试剂盒的稳定性，在操作过程中应严格按照说明书操作。

本研究仅为初步探索，纳入样本数较少，观点具有一定的局限性，有待后续进一步研究。