檀香紫檀内生真菌多样性与抗菌活性分析

施文广 梁金虎 冯美茹 李佳琪 黄李坤 张雪慧 邓祖军

摘要：【目的】分析藥源植物檀香紫檀内生真菌多样性及其代谢产物抗菌活性，为寻找新型抗菌活性物质提供参考。【方法】从广东药科大学中药园采集3株健康檀香紫檀的根、茎、叶组织样品，采用组织分离法分离其内生真菌;结合形态学和分子生物学方法对檀香紫檀内生真菌进行分类和鉴定;分别采用纸片扩散法和菌丝生长速率法研究代表性内生真菌发酵液对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC26003、大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC44102、痢疾杆菌（Shigella dysenteriae）CMCC51252、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）CMCC50115、白色念珠菌（C. albicans）ATCC10231和黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC98003的抗菌活性。【结果】从450块檀香紫檀组织中共分离到337株内生真菌，其中来自叶172株、茎66株、根99株，隶属15个属。叶部内生真菌的相对分离率和定殖率最高，均为79.63%;叶部、根部和茎部的内生真菌多样性指数分别为1.02、0.93和0.64，三者间差异显著（P<0.05）。木霉属（Trichoderma sp.）为根部优势属，相对分离率为28.28%;青霉属（Penicillium sp.）为茎部和叶部的优势属，相对分离率分别为46.97%和52.91%。45株代表性内生真菌发酵液抗菌活性测定结果显示，有16株内生真菌（35.56%）对金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌和痢疾杆菌具有抑菌活性;36株（80.00%）对白色念珠菌和黑曲霉具有抑菌活性;有15株（33.33%）对6种测试细菌和真菌均具抑制活性，其中菌株L9（Colletotrichum sp.）代谢产物的抗菌活性最好，对黑曲霉抑制活性达67.35%，对其余5种测试菌的抑菌圈直径均大于10 mm。【结论】檀香紫檀内生真菌类群分布具有一定的器官组织特异性，物种多样性较丰富，且蕴含有较高比例的抗细菌和抗真菌活性菌株，可为新型抗菌活性物质的筛选与开发提供菌株资源。

关键词： 檀香紫檀;内生真菌;生物多样性;抗菌活性

中图分类号： S792.29;S182                               文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）02-0538-09

Abstract：【Objective】The aim of this study was to investigate the biological diversity and antimicrobial activities of endophytic fungi of Pterocarpus santanilus，providing reference for new antimicrobial active substances. 【Method】Samples of roots， stems and leaves of three healthy P. santanilus plants were collected from the Chinese Medicine Garden of Guangdong Pharmaceutical University in Guangzhou. The endophytic fungi of P. santanilus were isolated by tissue block isolation method and were identified by morphological and molecular biological methods. The antimicrobial activities of endophytic fungi fermentation broth against Staphylococcus aureus CMCC26003， Escherichia coli CMCC44102， Shigella dysenteriae CMCC51252，Salmonella typhimurium CMCC50115，Candida albicans ATCC10231 and Aspergillus niger CMCC98003 were studied by the paper disk diffusion method and mycelium growth rate method respectively. 【Result】A total of 337 endophytic fungi were isolated from 450 P. santanilus tissues（172 in leaves， 66 in stems and 99 in roots）， belonging to 15 genera. The relative isolation rate and colonization rate of endophytic fungi in leaves were the highest， they were both 79.63%. The diversity index of endophytic fungi in leaves， stems and roots were 1.02， 0.93 and 0.64 respectively， and there was significant difference among them（P<0.05）. Trichoderma sp. genus was the dominant genus in root， and the relative isolation rate was 28.28%. Penicillium sp. genus was the dominant endophytic fungi genus of stems and leaves， and the relative isolation rates were 46.97% and 52.91% respectively. The results of the antimicrobial activities of the 45 endophytic fungi fermentation broth from P. santanilus showed that 16 strains（35.56%） had the antibacterial activity against E. coli CMCC44102， S. aureus CMCC26003， S. typhimurium CMCC50115 and S. dysenteriae CMCC51252; 36 strains（80.00%） showed the inhibition activity against C.albicans ATCC10231and A.niger CMCC98003.  And 15 strains（33.33%） could inhibit the growth of all the six pathogens. L9（Colletotrichum sp.） showed the best antimicrobial activities. It had an inhibitory activity of 67.35% against A. niger CMCC98003 and the diameter of inhibition zones against the other five pathogens were all more than 10 mm.【Conclusion】Theendophytic fungi communityin P. santanilus istissue specific， and the species diversity of P. santanilus endophytic fungi is rich， and there is a high proportion of endophytic fungi with good antibacterial and antifungal activities. The endophytic fungi of P. santanilus provide strain resources for screening and development of new antimicrobial active substances.

Key words： Pterocarpus santanilus; endophytic fungi; bio-diversity; antimicrobial activities

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31971384）

0 引言

【研究意义】药用植物是抗菌药物的重要来源，但许多药用植物生长周期相对较长，人工栽培推广较慢，产量低，资源供应较紧缺（沈徐婷和丁志山，2018;赵小惠等，2019），单纯从药用植物体提取和开发药用活性成分已很难满足人类的需求（吕婉婉等，2018）。同时，随着微生物耐药性越来越严重和超级细菌的频繁出现（李昕等，2020），已有抗菌药物也已不能完全满足临床抗菌治疗的需求。因此，寻找药用植物的替代资源以及开发新的抗菌药物显得尤为迫切，对于缓解植物药来源匮乏，丰富临床抗菌药物库具有重要意义。檀香紫檀（Pterocarpus santanilus Linn. f.）为蝶形花科（Papilionaceae）紫檀属（Pterocarpus）木本植物，在热带原始森林自然分布（Arunkumar and Joshi，2014）。檀香紫檀除作为名贵木材在家具和工艺品方面具有重要的应用价值外，还具有较高的药用价值。檀香紫檀的心材、树皮、种子和叶片提取物被发现具有多种药理活性（Bulle et al.，2016a;Donga et al.，2017;陈仁利和曾杰，2018; Akhouri et al.，2020），主要应用于护肝及口腔疾病、皮肤病、神经过敏等疾病的治疗（Bulle et al.，2016b）。檀香紫檀作为一种具有广泛药理活性的药源植物，市场需求量大，但檀香紫檀被过度砍伐，目前其野生资源已近枯竭，市场供应极为紧缺（Arunkumar and Joshi，2014;Teixeira da Silva et al.，2019）。因此，寻找可行的替代资源以解决檀香紫檀资源紧缺问题，实现其药用资源的充分挖掘和利用已成为檀香紫檀产业面临的一个重要课题。【前人研究进展】药用植物内生真菌已成为天然活性代谢产物的一个重要资源库，而且相对于药用植物，内生真菌更易繁殖，因而内生真菌为解决药用植物资源紧缺，全面挖掘和利用其蕴含的药用资源提供了新思路（罗利琼等，2016;郭顺星，2018）。植物内生真菌作为一类长期生活在宿主体内的共生真菌，一般情况下不会导致宿主出现明显病害症状（Deng et al.，2014;颜桢灵等，2019）。药用植物内生真菌生境较特殊，且与宿主植物存在紧密的共生关系，大量研究表明药用植物内生真菌不仅普遍存在与宿主植物类似的生理活性的次生代谢产物，还蕴含着大量的具有独特化学结构和广泛生理活性的次生代谢产物（杨鼎超等，2017;Venieraki et al.，2017;張晓云等，2020;Mangan-yi and Ateba，2020）。Martínez-Luis等（2012）从紫茉莉（Guapira standleyana）叶中的内生真菌Aspergillus sp. strain F1544中分离到5种具有抗寄生虫活性的化合物（Pseurotin A、14-norpseurotin A、FD-838、Pseurotin D、Fumoquinone B）;Uzor等（2016）发现从药用植物法氏花椒（Fagara zanthoxyloides）叶中分离到的内生真菌茶拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis thea）可产生对呼吸道合胞病毒增殖具有显著抑制活性的氯异硫氰酸（Chloroisosulochrin）;Prihantini和Tachibana（2017）发现从药用植物杜英（Elaeocarpus chinensis）的内生真菌Pseudocercospora sp. ESL 02中分离到的土曲霉酸（Terreic acid）和6-甲基水杨酸（6-methylsalicylic acid）具有很强的抗氧化活性，其DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）自由基清除活性半抑制浓度（IC50）分别高达0.22和3.87 mmol/L;Kornsakulkarn等（2018）从药用植物南酸枣[Choerospondias axillaris（Roxb.） Burtt. et Hill]的黑孢霉属（Nigrospora sp.）内生真菌Nigrospora sp. BCC 47789代谢产物中分离到一种对口腔表皮样癌细胞（KB）、人乳腺癌细胞（MCF-7）和人肺癌细胞（NCI-H187）均具细胞毒性的新的氢蒽醌（Nigrosporone A）;Venkateswarulu等（2018）发现分离自药用植物榄仁果（Terminalia pallida）的内生真菌Cladosporium delicatulum产生的白花丹素（5-hydroxyl-2-methylnaptalene-1，4-dione）具有很强的抗真菌活性，其对白色念珠菌（Candida albicans）、热带念珠菌（C. tropicalis）、稻小核菌（Sclerotium oryzae）和串珠镰孢菌（Fusarium moniliforme）的最小抑菌浓度（MIC）均不高于12.5 mg/mL;Manganyi等（2019）发现南非传统药用植物Sceletium tortuosum L.内生真菌尖孢镰刀菌（F. oxysporum）GG 008的发酵液对蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）ATCC 10876表现出明显的抑菌活性。目前，药用植物檀香的提取物也已发现具有多种药理活性，Wu等（2011）从檀香紫檀心材分离到对人类中性粒细胞分泌弹性蛋白酶具有抑制活性的新的菲二酮（Pterolinus K）和查尔酮（Pterolinus L）;Bulle等（2016a）发现檀香紫檀心材的甲醇提取物可通过降低脂质过氧化的速率，增强抗氧化防御机制来减轻小鼠酒精诱发的肝损伤，显示出较好的护肝作用;Li等（2018）从檀香紫檀心材提取物中分离到3种新型的倍半萜烯（Canusesnol L、12，15-dihydroxycurcumene和Canusesnol K）;Akhouri等（2020）发现檀香紫檀种子提取物可抑制由DMBA[7，12-dimethylbenz（α）-anthracene]诱导的乳腺癌在小鼠体内的生长，表现出较好的抗肿瘤活性。【本研究切入点】近年来，研究者们已陆续对多种药用植物内生真菌的次生代谢产物进行了研究，但仍有大量药用植物的内生真菌资源有待研究和开发（武艳霜等，2019）。檀香紫檀作为一类资源紧缺的重要药源植物，关于其内生真菌生物多样性及活性物质的研究尚无文献报道。【拟解决的关键问题】采用组织分离法从檀香紫檀的根、茎和叶等部位分离内生真菌，结合形态学和基于ITS-rDNA序列分析方法对内生真菌进行鉴定，阐明檀香紫檀各部位内生真菌的类群结构和生物多样性特征，为檀香紫檀内生真菌药用资源的挖掘和利用提供前期基础;同时，通过纸片扩散法和菌丝生长速率法进一步分析檀香紫檀内生真菌发酵液的抗细菌和抗真菌活性，筛选出具有优良抗菌活性的内生真菌菌株，为抗菌活性物质提供资源库，也为解决檀香紫檀资源紧缺、充分利用其药用资源供新思路。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 供试药用植物 供试3株檀香紫檀（Pterocarpus santanilus Linn. f.）2年生，株高約0.5 m、树干直径约2 cm，于2019年7月采自广东药科大学中药园（东经113°24′31.8″，北纬23°03′31.9″）。3株檀香紫檀用无菌袋包装，4 ℃低温保存于广东药科大学病原生物学与免疫学系研究室。用无菌剪刀从檀香紫檀剪出450块大小均一的植物组织用于分离内生真菌，其中根部组织138块、茎部组织96块、叶部组织216块。

1. 1. 2 供试病原菌 供试细菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC26003、大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC44102、痢疾杆菌（Shigella dysenteriae）CMCC51252、伤寒沙门氏菌（Salmone-lla typhimurium）CMCC50115;供试真菌：白色念珠菌（C. albicans）ATCC10231、 黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC98003。以上菌株均由广东药科大学病原生物学与免疫学研究室提供。

1. 1. 3 供试试剂 营养琼脂（NA）和营养肉汤（NB）培养基，马铃薯葡萄糖固体（PDA）和液体（PDB）培养基（广东环凯微生物科技有限公司）;真菌DNA提取试剂盒（广州美基生物科技有限公司），PCR预混液（含Taq DNA聚合酶）、引物（ITS1F：5'-CT TGGTCATTTAGAGAAGTAA-3'，ITS4：5'-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3'）和DNA Marker[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 内生真菌的分离与纯化 檀香紫檀内生真菌分离和纯化参考Cao等（2002）的方法。

1. 2. 2 内生真菌鉴定 真菌用载玻片培养法（Cao et al.，2002）培养后，光学显微镜下对其菌丝、孢子和子实体结构进行观察，分类鉴定依据《真菌鉴定手册》（魏景超，1979）。内生真菌的分子鉴定参考Deng等（2014）的方法进行，具体步骤：使用真菌DNA提取试剂盒抽提内生真菌总DNA，利用引物ITS1F和ITS4 PCR扩增其内转录间隔区序列（Internal transcribed spacer，ITS）。PCR反应体系25.0 μL： 2×Pro Taq Master Mix（dye plus）12.5 μL，1.0 μmol/L正、反向引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O补足至25.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 min，72 ℃ 90 s，进行30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。ITS-rDNA序列的测序结果在NCBI数据库中进行BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对。选取与高相似性序列同属不同种的模式菌株序列作为参考序列，并选取与待测菌株亲缘关系适中的同科不同属序列作为外类群，利用MEGA 7.0采用邻接法构建系统发育进化树。

1. 2. 3 内生真菌抗菌活性筛选 从分离获得的内生真菌中挑选不同菌属的代表性菌株用于抗菌活性筛选。在含100 mL PDB液体培养基的300 mL锥形瓶中接入活化好的内生真菌，28 ℃、160 r/min液体发酵5～7 d。发酵液先经8层灭菌纱布过滤收集，再12000 r/min离心5 min冷冻离心，上清液用0.22 ?m微孔滤膜过滤，得到的无菌发酵液于4 ℃保存备用。檀香紫檀内生真菌发酵液抗菌活性（细菌和白色念珠菌）检查采用纸片扩散法（张丽等，2019）;参考Li等（2018）采用菌丝生长抑制法分析内生真菌对黑曲霉的抑制效果。

1. 3 统计分析

檀香紫檀内生真菌的定殖率（CR）、分离率（IF）、相对分离频率（RF）、Shannon-Wiener多样性指数（H'）、均匀度指数（E）和相似性指数（Cs）参考刘军等（2018）的方法进行计算和分析。檀香紫檀根、茎和叶的定殖率、分离率和多样性指数比较采用Duncans多重比较法进行分析。

2 结果与分析

2. 1 檀香紫檀内生真菌分离率和定殖率分析

从450块檀香紫檀组织中共分离到337株内生真菌，其中来自叶172株、茎66株、根99株（表1） 。檀香紫檀内生真菌总分离率和定殖率均为74.89%;内生真菌在檀香紫檀各部位的定殖率和分离率排序为叶（79.63%和79.63%）>根（71.74%和71.74%）>茎（68.75%和68.75%），各部位内生真菌的定殖率与分离率变化规律相同。

2. 2 檀香紫檀内生真菌的类群组成分析

结合形态学和ITS-rDNA序列分析对337株内生真菌进行鉴定，结果（表2）表明，337株内生真菌隶属于15个属，优势属为青霉属（Penicillium，占40.95%）和炭疽属（Collectorichum，占18.40%）。檀香紫檀各部位的内生真菌类群分布存在较大差异，其中，根部共分离到9个属的内生真菌，木霉属（Trichoderma，占28.28%）为优势类群;茎部和叶部各分离到10个属和6个属的内生真菌，优势类群均为青霉属，分别占茎部和叶部内生真菌数的46.97%和52.91%。在檀香紫檀分离到的15个属中，根、茎和叶3个部位均存在炭疽属、间座壳属（Diaporthe）、青霉属和拟茎点霉属（Phomopsis）4个属;木霉属分布在根和茎2个部位，链格孢属（Alternaria）分布在茎和叶2个部位;Barssia、镰孢霉属（Fusarium）、Gliocladiopsis和毛色二孢属（Lasiodiplodia）4个属只分布在根部，壳多孢属（Stagonospora）、拟青霉属（Purpureocillium）、拟盾壳霉属（Paraconiothyrium）和Setophaeosphaeria 4个属只分布在茎部，而曲霉属（Aspergillus）只分布在叶部。

2. 3 檀香紫檀不同部位内生真菌多样性和相似性分析

檀香紫檀内生真菌总体生物多样性指数为1.90，各部位内生真菌多样性指数依次为叶（1.02）>根（0.93）>莖（0.64），各部位内生真菌多样性指数差异显著（P<0.05，下同）;各部位内生真菌均匀度指数依次为叶（0.57）>根（0.42）>茎（0.28），各部位内生真菌均匀度指数差异显著（表3）。

根据Jaccard相似性系数原理，当相似性指数介于0.00～0.25时为极不相似，0.25～0.50为中等不相似，0.50～0.75为中等程度相似，0.75～1.00为极为相似。从表3可看出，茎与叶、根与茎和根与叶的内生真菌类群结构均为中等程度相似，相似性指数分别为0.63、0.53和0.53。

2. 4 檀香紫檀内生真菌对病原细菌和病原真菌的抑菌活性

从337株内生真菌中挑选不同菌属的45株代表性菌株进行抗菌活性测定。结果（表4）显示，有16株（占35.56%）内生真菌对金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌和痢疾杆菌4种测试细菌具有抑菌活性，36株（占80.00%）内生真菌对白色念珠菌和黑曲霉2种测试真菌具有抑菌活性，有15株（占33.33%）内生真菌对6种测试病原菌表现出抑制活性，分别为L2（青霉菌Penicillium sp.）、L3（炭疽菌Collectorichum sp.）、L6（链格孢菌Alternaria sp.）、L9（炭疽菌Collectorichum sp.）、L10（炭疽菌Collectorichum sp.）、L11（曲霉菌Aspergillus sp.）、L14（曲霉菌Aspergillus sp.）、S5（炭疽菌Collectorichum sp.）、R2（Gliocla-diopsis sp.）、R3（炭疽菌Collectorichum sp.）、R9（间座壳菌Diaporthe sp.）、R10（炭疽菌Collectorichum sp.）、R11（炭疽菌Collectorichum sp.）、R12（间座壳菌Diaporthe sp.）和R17（毛色二孢菌Lasiodiplodia sp.），其中菌株L9的抑菌能力尤为突出，对黑曲霉的抑制活性达67.35%，对其余5种测试菌的抑菌直径均大于10 mm。根据BLAST结果可知，菌株L9的ITS与GenBank中C. vietnamense strain CBS 125478（MH863700.1）的同源性为99.23%。基于真菌ITS-rDNA序列构建菌株L9系统发育进化树，结果（图1）显示，菌株L9与越南炭疽菌（C. vietname-nse）中的2个序列[C. vietnamense strain CBS 125478（MH863700.1）和C. vietnamense strain CBS 125477（MH863699.1）]的亲缘关系相对较近，构成一个支持度为83%的聚类分支，暂将其鉴定为炭疽菌属真菌。

3 讨论

本研究从檀香紫檀不同部位组织中分离获得15属共337株内生真菌，表明檀香紫檀分布着较丰富的内生真菌资源。檀香紫檀内生真菌的总定殖率、总分离率和总多样性指数分别为74.89%、74.89%和1.90，与其他研究中报道的热带、亚热带植物的分离水平较接近（臧威等，2014），但高于多数已报道的北方温带药用植物（朱军等，2015），可能由于相对于北方温带地区，热带和亚热带地区环境湿度大和降水多，从而更有利于内生真菌的侵染和定殖（Porras-Alfaro and Bayman，2011;臧威等，2014）。与朱军等（2015）的研究结果类似，本研究也发现檀香紫檀根部内生真菌的生物多样性指数高于茎部。土壤微生物是植物内生真菌的主要来源，其生物多样性高，更容易通过根部伤口或开口侵染进入植物根部，这可能是根部内生真菌生物多样性相对较高的重要原因（Torsvik and ?vre?s，2002;Compant et al.，2016;Fesel and Zuccaro，2016）。从檀香紫檀中共分离到15个属的内生真菌，木霉属为根部的优势类群，茎部和叶部的优势类群均为青霉属。在15个属的内生真菌中，有9个属只在根、茎、叶中的一个部位有分布，其中，Barssia、镰孢霉属、Gliocladiopsis和毛色二孢属只分布在根部，壳多孢属、拟青霉属、拟盾壳霉属和Setophaeosphaeria只分布在茎部，而曲霉属仅在叶部有分布，表明檀香紫檀内生真菌类群分布具有一定的器官与组织专一性，可能是由檀香紫檀体内不同部位的微环境差异所造成（Comby et al.，2016）。此外，Barssia、Setophaeosphaeria和壳多孢属的内生真菌在檀香紫檀有特异性分布，在其他药用植物中尚未分离到，可能与檀香紫檀体内独特的微环境有关（王景仪等，2020）。

药用植物内生真菌已成为新药开发的一个重要资源库，其不仅可合成与药用植物相同或相似的活性物质，而且还蕴含大量的新结构和新活性的次生代谢产物（Ancheeva et al.，2020）。目前多种抗肿瘤、抗病毒和抗菌活性物质已在药用植物内生真菌中分离到（Chen et al.，2016）。檀香紫檀树皮与叶的提取物被证实对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、产气肠杆菌等多种病原细菌及白色念珠菌、新型隐球菌、光滑念珠菌等酵母菌具有良好的抑制活性（Zamare et al.，2013;Donga et al.，2017），研究者还在檀香紫檀多个部位的提取物分离到多种新结构的活性物质（Krishnaveni and Srinivasa Rao，2000;Kesari et al.，2004;Li et al.，2018），但目前未见关于檀香紫檀内生真菌次生代谢产物研究的相关报道。本研究对檀香紫檀中45株代表性内生真菌发酵液的抗菌活性测定发现，有16株内生真菌对金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌和痢疾杆菌等4种测试细菌具有抑菌活性，36株内生真菌对白色念珠菌和黑曲霉2种测试真菌具有抑菌活性，15株内生真菌对6种测试病原菌均表现出抑制活性，表明檀香紫檀存在较高比例的具有抗菌活性的内生真菌菌株，为全面挖掘檀香紫檀的抗菌活性物质提供了菌株资源，同时也为解决檀香紫檀资源紧缺、科学利用其药用资源供了新思路，但其具体的活性成分的化学结构及生理功能有待进一步探究。

4 结论

檀香紫檀内生真菌类群分布具有一定的器官组织特异性，物种多样性较丰富，且蕴含有较高比例的抗细菌和抗真菌活性菌株，可为新型抗菌活性物质的筛选与开发提供菌株资源。

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（責任编辑 麻小燕）