思茅松毛虫关键龄期幼虫肠道可培养细菌多样性分析

李选文 熊忠平 张珊 黄雨云 周艺萍 聂中良 潘鸿静 熊智

摘要：【目的】对思茅松毛虫（Dendrolimu kikuchii）关键龄期幼虫肠道可培养细菌多样性进行研究，探索其肠道细菌资源及多样性，为深入研究昆虫肠道微生物功能及思茅松毛虫的种群管理打下基础。【方法】采用传统微生物分离培养法对采集自云南省安宁市草铺镇林区的思茅松毛虫1、4和7龄幼虫进行肠道细菌分离纯化，对分离获得的细菌进行16S rDNA序列同源性分析，初步判定其分类学地位并进行多样性分析。【结果】从思茅松毛虫幼虫肠道中共分离得到291株细菌，隶属于15属31种，其中1龄幼虫肠道98株细菌隶属于9属13种，4龄幼虫肠道102株细菌隶属于6属12种，7龄幼虫肠道91株细菌隶属于6属9种。在31个细菌种中，芽孢杆菌属（Bacillus）最多，共有9个种，占总种数的29.03%，其次是肠杆菌属（Enterobacter）和葡萄球菌属（Staphylococcus）各有4个种，分别占总种数的12.90%。13个1龄幼虫肠道细菌种中，葡萄球菌属、肠杆菌属和芽孢杆菌属的相对分离率分别为27.54%、21.43%和21.43%，高于其他菌属的平均分離率（5.31%）;12个4龄幼虫肠道细菌种中，芽孢杆菌属的相对分离率为72.53%，高于其他菌属的平均分离率（5.49%）;9个7龄幼虫肠道细菌种中，克雷伯氏菌属（Klebsiella）和肠杆菌属的相对分离率分别为43.96%和18.68%，高于其他菌属的平均分离率（9.34%）。思茅松毛虫1龄幼虫肠道细菌的优势度指数、丰富度指数和Shannon-Weiner指数均最大，分别为0.9032、2.6172和2.4310，7龄幼虫肠道细菌的均匀度指数最大，为0.9634。【结论】思茅松毛虫1、4和7龄幼虫肠道可培养细菌群落组成和结构丰富，具有丰富的细菌资源。

关键词： 思茅松毛虫;幼虫;肠道细菌;多样性;分离;16S rDNA

中图分类号： S433.4;Q993.3                文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）02-0527-11

Abstract：【Objective】To study the diversity of culturable bacteria in the intestines of critical instar larvae of Dendrolimu kikuchii， and to explore the resources and diversity of intestinal bacteria， so as to lay a foundation for further research on the function of insect intestinal microorganisms and population management of D. kikuchii. 【Method】Traditional methods of microorganism isolation，pure culture and identification were used to isolate and purify the intestinal bacteria from the 1st， 4th， and 7th instar larvae collected from the forest area of Caopu Town， Anning City， Yunnan Province. The 16S rDNA sequence homology analysis of the isolated bacteria was conducted to preliminarily determine their taxonomic status and conduct diversity analysis. 【Result】A total of 291 strains of bacteria were isolated from the intestines of D. kikuchii larvae， belonging to 31 species of 15 genera. Among them， 98 strains of the intestines of the 1st instar larvae belonged to 13 species of 9 genera， 102 strains of the 4th instar larvae belonged to 12 species of 6 genera， and 91 strains of the 7th instar larvae belonged to 9 species of 6 genera. Among the 31 bacterial species， Bacillus was the most， with 9 species， accounting for 29.03%， followed by Enterobacter and Staphylococcus with each 4 species， accounting for 12.90% of the total species respectively. Among the thirteen 1st instar larvae， the relative isolation rates of Staphylococcus， Enterobacteria and Bacillus were 27.54%， 21.43% and 21.43%， respectively， which were higher than the average isolation rates of other bacteria（5.31%）. Among the twelve 4th instar larvae， the relative isolation rate of Bacillus was 72.53%， higher than the average isolation rate of other genera（5.49%）. Among the nine 7th instar larvae， the relative isolation rates of Klebsiella and Enterobacteria were 43.96% and 18.68%， respectively， which were higher than the average isolation rates of other bacteria （9.34%）.The dominant index， richness index and Shannon-Weiner index of intestinal bacteria of the 1st instar larvae were the highest， which were 0.9032， 2.6172 and 2.4310， respectively. The evenness index of intestinal bacteria of the 7th instar larvae was the highest， which was 0.9634. 【Conclusion】The composition and structure of culturable bacterial communities of the 1st， 4th and 7th instar larvae in the intestines of D. kikuchii are rich， and there are abundant bacterial resources.

Key words： Dendrolimus kikuchii; larvae; intestinal bacteria; diversity; isolation; 16S rDNA

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31660029）; Major Science and Technology Proje-cts of Yunnan （202002AA1000）

0 引言

【研究意义】思茅松毛虫（Dendrolimu kikuchii）又名赭色松毛虫，鳞翅目（Lepidoptera）枯叶蛾科（Lasiocampidae）松毛虫属（Dendrolimus），因最早在云南的思茅发现而命名（侯陶谦，1987）。该虫在云南思茅地区主要危害思茅松，在昆明周边主要危害滇油杉（白林喜等，2016;聂中良等，2019）。思茅松毛虫是危害最严重的6种松毛虫之一，严重时会使大量松科植物枯萎死亡，状如火烧，严重影响相关地区的生态环境和旅游业（程克华，2018）。此外，思茅松毛虫幼虫体表长有毒毛，人畜接触后会引发严重皮炎，甚至导致人类致病、致残、致盲等（王寅威等，1999;苏有顺，2016），给当地人们的生产生活带来极大不便。昆虫肠道微生物参与宿主的多项生理活动，除可为宿主提供营养、解毒，增强宿主免疫力等有益作用外，还可能对宿主健康造成影响，在害虫防治方面具有巨大潜力;宿主则为肠道细菌提供食物和定殖场所，二者相互依存、互利共生（张振宇等，2017;杜慧民等，2020）。随着化学杀虫剂的大量使用，思茅松毛虫已产生了一定的抗药性（邓秀明，2002）。因此，研究思茅松毛虫肠道可培养细菌的种群结构和多样性，有助于微生物杀虫剂的开发和利用，为思茅松毛虫的防控打下基础。【前人研究进展】近年来，随着动物肠道微生物研究的不断深入，有关昆虫肠道微生物的研究也日益增多。研究表明，大多数昆虫肠道微生物包括细菌、真菌、古细菌和原生生物，而细菌丰度最高，约占90%以上，是其中的优势菌群（Philipp and Moran，2003）。在家蚕（Bombyx mori）肠道微生物中存在大量的好氧细菌，春蚕肠道优势菌以肠杆菌属（Enterobacter）、微球菌属（Micrococcus）和芽孢杆菌属（Bacillus）细菌为主，秋蚕肠道好氧菌只有少量微球菌属（Russo et al.，2015）;其肠道菌群结构与其特殊的食性有关，食料改变及生长受阻后肠道微生物平衡也会发生变化（相辉等，2007）。王金昌等（2017）通过Illumina HiSeq高通量测序研究了甘南尕海高寒草地4龄草原毛虫幼虫肠道细菌群落组成，发现10个细菌门。王蕊蕊等（2018）采用传统的微生物培养方法研究了桉树枝瘿姬小蜂（Leptocybe invasa Fisher & La Salle）成虫肠道可培养细菌的多样性，共分离得到11株细菌，其中厚壁菌门（Firmicutes）中的芽孢杆菌属为优势菌属。张志红等（2020）采用传统的微生物培养方法研究了云南芒市草地贪夜蛾[Spodoptera frugiperda （J.E. Smith）]5龄幼虫肠道可培养细菌，共分离得到6种细菌，变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）为优势菌种。有关松毛虫肠道微生物的研究也有一些报道。张珊等（2019）采用传统的微生物培养方法研究了思茅松毛虫4龄幼虫肠道可培养真菌，共分离鉴定出12株真菌，其中小孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsis microspora）产蛋白酶能力最强，产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum）产淀粉酶能力最强，菌核青霉（P. sclerotiorum）产纤维素酶能力最强，青霉菌属（Penicillium）为优势菌属。江宇航等（2020a，2020b）采用传统的微生物培养方法研究了马尾松毛虫（D. punctatus）幼虫肠道可培养产细菌素和产蛋白酶细菌，发现解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）产细菌素活性最高，地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）产蛋白酶能力最强。对落叶松毛虫（D. superans）和赤松毛虫（D. spectabilis）的研究多集中于生物学特性及防控方面（梁立明，2018;李和爽，2019;赵佳，2020;周俊华等，2020）。【本研究切入点】国内关于鳞翅目的其他昆虫肠道微生物多有报道，但关于思茅松毛虫1、4和7龄幼虫可培养细菌群落组成和多样性尚无文献报道。【拟解决的关键问题】以健康的思茅松毛虫1、4和7龄幼虫为材料，采用传统的分离培养法及16S rDNA同源性分析对其肠道可培养细菌进行分離鉴定，明确其肠道细菌资源及多样性，为深入研究昆虫肠道微生物的功能及思茅松毛虫的种群管理打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

思茅松毛虫1、4和7龄幼虫采自云南省安宁市草铺镇林区（东经102°08′～102°37′，北纬24°31′～25°06′）。在林区随机挑选10个样点，每个样点每龄期分别采集15头健康的思茅松毛虫幼虫，带回实验室备用。1龄幼虫主要特征：整体呈黑色间橘黄色和白色，体表长有白色绒毛，背部有一条白色或黄色的中线，背中线两侧黑色，虫体两侧橘黄色间白色;头壳橘黄色，头部后面有一块白色的斑点，虫体下方分布有多对足，腹足与尾足为黑色间淡黄色，虫体长度5～10 mm（图1-A）。4龄幼虫主要特征：整体呈橘黄色间白色和黑色，体表绒毛染色加深为黑色，背中线橙黄色，虫体两侧棕色间乳白色;头壳棕色，腹足与尾足为黑色间淡黄色，虫体长度20～35 mm（图1-B）。7龄幼虫主要特征：整体呈黑色间橘黄色，绒毛颜色加深变为橙红色和黑色，背中线黑色，背中线两侧橘黄色间白色，虫体两侧黑色间橘黄色，背中线两侧毛束与虫体两侧毛束前几对为橙红色，后面为白色，白色毛束有1～5对不等;头壳棕黄间黑色，腹足与尾足为黑色间淡黄色，虫体长度60～70 mm（图1-C）。

1. 2 分离培养基

牛肉膏蛋白胨培养基（NA）（王蕊蕊等，2018）：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，蒸馏水补充至1000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min。

1. 3 肠道细菌的分离纯化

分别随机选取100头健康的1、4和7龄幼虫，在温度22～24 ℃、湿度80%～85%条件下，每20头幼虫放在一个装有50 mL无菌水的无菌培养皿内喂养，试验前40 h停止喂食，待其排空体内食物残渣后进行试验。将思茅松毛虫幼虫置于冰上3～5 min，待其昏迷;用70%酒精擦拭虫体表面30 s，0.25%次氯酸钠冲泡1 min，无菌水冲洗3次;随后将其固定于无菌蜡盘上，使用灭菌后的细尖钳将幼虫腹部剖开，取出整个肠道，并立即用0.9%无菌NaCl溶液冲洗表面2次，然后将肠道取出置于无菌离心管内，向离心管中加入1 mL PBS缓冲液研磨成匀浆，备用。

吸取上述肠道匀浆1 mL置于9 mL PBS缓冲液中，稀释成10-1，按照10的倍数进行梯度稀释，制成10-2、10-3、10-4和10-5悬浮液，每个浓度吸取100 mL稀释液分别涂布于NA培养基中，每个梯度涂3个平板。涂板均匀后将培养平板倒置于37 ℃培养箱中培养72 h后，选择单菌落数在30～300的培养皿，根据涂有肠道内容物悬液培养皿上的单菌落的不同特征，挑取单菌落至新的NA培养基上，采用分区划线法进行纯化，直至菌株形态基本一致，得到纯菌株。将得到的菌种保藏于NA斜面培养基中，4 ℃保存备用。

1. 4 幼虫肠道细菌DNA提取及PCR扩增

将分离得到的不同肠道细菌在NA培养基上活化，接种至NA液体培养基扩大培养，离心;收集菌体，然后将1 mL培养好的细菌菌液按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]使用说明提取肠道细菌基因组DNA。提取的产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，将检测合格的DNA产物作为16S rDNA序列扩增模板，采用16S rDNA通用扩增引物：27F：5'-AGAGTTTGATC CTGGCTGAG-3';1492R：5'-TACGGCTACCTTGTT ACGACTT-3'。PCR反应体系50.0 mL：2×Tap PCR MasterMix 25.0 mL，DNA模板3.0 mL，10.0 mmol/L正、反向引物各1.0 mL，双蒸水补足至50.0 mL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，进行30个循环;72 ℃延伸5 min，-20 ℃保存。取4.0 mL PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测合格的PCR扩增产物送至昆明硕擎生物科技有限公司进行测序。

1. 5 幼虫肠道细菌的系统发育进化树构建

测得的序列通过DNAMAN 6.0进行矫正及拼接，将拼接好的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST同源性比对，选取同源性最高序列作为参照菌株序列，与获得的细菌16S rDNA一起，运用MEGA 7.0构建Neighbor-Joining系统发育进化树，用Bootstrap法计算1000次进行检测，判定其分类学关系。

1. 6 分离率及多样性指数

根据鉴定结果，计算思茅松毛虫幼虫肠道细菌的相对分离率（指分离到的某种幼虫肠道细菌株数占分离到的总菌株数的百分率，用来衡量某种幼虫肠道细菌的优势度）（余仲东等，2016），并分析幼虫肠道细菌群落结构多样性（郑梅霞等，2019）。多样性指数计算公式：

式中，S表示某个龄期幼虫肠道细菌的种类数，N表示某个龄期幼虫肠道细菌的总量，Pi表示某个龄期幼虫肠道细菌的相对分离率。

2 结果与分析

2. 1 思茅松毛虫幼虫肠道细菌的分离纯化结果

思茅松毛虫1龄幼虫共分离获得98株细菌，根据菌落形态特征将98株细菌分为13个类群，整理编号为N101～N113;4龄幼虫共分离获得102株细菌，根据菌落形态特征将102株细菌分为12个类群，整理编号为N401～N412;7龄幼虫共分离获得91株细菌，根据菌落形态特征将91株细菌分为9个类群，整理编号为N701～N709。

2. 2 思茅松毛虫幼虫肠道可培养细菌鉴定结果

提取分离获得的细菌DNA，经检测合格后测序，应用16S rDNA基因序列鉴定，NCBI数据库在线比对，将所获得的幼虫肠道细菌16S rDNA序列在GenBank中注册，获得GenBank登录号（表1），初步将分离获得的291株细菌鉴定为15个属，31个种，其中1龄幼虫肠道98株细菌隶属于9属13种，4龄幼虫肠道102株细菌隶属于6属12种，7龄幼虫肠道91株细菌隶属于6属9种;部分幼虫肠道细菌菌落形态如图2。在31个细菌种中，芽孢杆菌属（Bacillus）最多，共有9个种，占总种数的29.03%，其次是肠杆菌屬（Enterobacter）和葡萄球菌属（Staphylococcus）各有4个种，分别占总种数的12.90%。

2. 3 系统发育进化树分析结果

对思茅松毛虫1、4和7龄幼虫肠道细菌分别构建系统发育进化树。1龄幼虫肠道细菌主要聚为两大类，分别是厚壁菌门的葡萄球菌属、小细菌属（Microbacterium）、科萨克氏菌属（Kosakonia）和芽孢杆菌属，变形菌门的泛生菌属（Pantoea）、肠杆菌属、沙雷氏菌属（Serratia）、假单胞菌属（Pseudomonas）和类香味菌属（Myroides）（图3）;4龄幼虫肠道细菌主要聚为三大类，第一类是厚壁菌门的葡萄球菌属（Staphylococcus）和芽孢杆菌属，第二类是变形菌门的单胞菌属（Stenotrophomonas）和假单胞菌属，第三类是金黄杆菌属（Chryseobacterium）（图4）;7龄幼虫肠道细菌主要聚为三大类，第一类是变形菌门的克雷伯氏菌属（Klebsiella）、肠杆菌属、沙雷氏菌属和单胞菌属，第二类是厚壁菌门的肠球菌属（Enteroco-ccus），第三类是产碱杆菌属（Alcaligenes）（图5）。1龄幼虫中N101、N112、N108和N105，7龄幼虫中N704和N708在系统发育进化树上未与NCBI中比对的最高序列菌株聚在一起，疑似新种资源，有待进一步探究。

2. 4 思茅松毛虫幼虫肠道细菌生境分布分析结果

对从思茅松毛虫幼虫肠道分离出的细菌数量和相对分离率进行分析，结果表明，芽孢杆菌属是幼虫肠道的优势菌属（表2）。

不同龄期，思茅松毛虫幼虫肠道细菌的优势菌种存在差异。13个1龄幼虫肠道细菌种中，葡萄球菌属（木糖葡萄球菌、琥珀葡萄球菌和腐生葡萄球菌）、肠杆菌属（阿氏肠杆菌和香坊肠杆菌）和芽孢杆菌属（枯草芽孢杆菌和特基拉芽孢杆菌）的相对分离率分别为27.54%、21.43%和21.43%，高于其他菌属的平均分离率（5.31%）。12个4龄幼虫肠道细菌种中，芽孢杆菌属（巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、厦门芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌和莫海威芽孢杆菌）的相对分离率为72.53%，远高于其他菌属的平均分离率（5.49%）。9个7龄幼虫肠道细菌种中克雷伯氏菌属（产酸克雷伯菌、变栖克雷伯氏菌和密歇根克雷伯菌）和肠杆菌属（香坊肠杆菌和路德维希肠杆菌）的相对分离率分别为43.96%和18.68%，高于其他菌属的平均分离率（9.34%）。

2. 5 思茅松毛虫幼虫肠道细菌多样性分析结果

思茅松毛虫1龄幼虫肠道细菌的优势度指数最大，为0.9032，其次是4龄幼虫（0.8883），7龄幼虫最小（0.8745）（图6-A）;1龄幼虫肠道细菌的丰富度指数最大，为2.6172，其次是4龄幼虫（2.3784），7龄幼虫最小（1.7913）（图6-B）;1龄幼虫肠道细菌的Shannon-Weiner指数最大，为2.4310，其次是4龄幼虫（2.3294），7龄幼虫最小（2.1169）（图6-C）;7龄幼虫肠道细菌的均匀度指数最大，为0.9634，其次是1龄幼虫（0.9478），4龄幼虫最小（0.9374）。

3 讨论

本研究对思茅松毛虫关键龄期幼虫肠道细菌进行了多样性分析，结果显示，1龄幼虫肠道优势细菌属为葡萄球菌属、肠杆菌属和芽孢杆菌属，4龄幼虫肠道优势细菌属为芽孢杆菌属，7龄幼虫肠道优势细菌属为克雷伯氏菌属和肠杆菌属。鳞翅目幼虫肠道细菌随着龄期的改变，其肠道优势菌群也会发生一定变化，究其原因是食物因素造成肠道细菌组成不同，1龄幼虫取食量较少，而4龄幼虫取食量迅速增加，7龄幼虫则是幼虫的最后一个时期，取食量最大（熊忠平等，2018）;从另一方面也暗示上述葡萄球菌属、肠杆菌属、芽孢杆菌属和克雷伯氏菌属对思茅松毛虫的生长发育、免疫和解毒等有重要作用。高珊珊（2018）对3种鳞翅目昆虫棉铃虫、桃蛀螟和玉米螟的幼蟲肠道可培养细菌进行多样性分析，发现优势菌属为沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属和肠球菌属;何欢（2019）以3种不同饲养条件的大蜡螟为研究对象，通过传统分离方法及ITS rDNA、16S rRNA基因序列分析研究其肠道微生物，发现芽孢杆菌属和肠球菌属为优势菌属;王莹（2020）通过Illumina HiSeq高通量测序研究了东方菜粉蝶（Pieris canidia）成虫和幼虫肠道微生物群落组成，发现肠杆菌属的细菌丰度最高。不同种类的昆虫，其肠道细菌种类不同，昆虫肠道可培养细菌的群落组成与昆虫的种类、食性、生存环境等有着密切关系（杨云秋等，2018）。马艳芳等（2012）、孙佑赫等（2012）分别对普洱市宁洱县磨黑镇4龄和7龄思茅松毛虫肠道细菌的研究中也发现优势菌属为短芽孢杆菌属和肠杆菌属，说明不同地区的思茅松毛虫肠道可培养细菌有相似的地方，也有不同之处。究其原因可能是由于不同地区思茅松毛虫幼虫取食量不同，气候（安宁河谷性气候、宁洱亚热带山地季风气候）、气温（安宁平均气温16～26 ℃、宁洱平均气温20.8 ℃）（蒙蒙，2012;李清，2015）、培养基和培养条件差异等外部条件影响了幼虫肠道的细菌种类。

孙博通等（2017）采用传统的微生物培养方法研究了斜纹夜蛾（Spodoptera litura）4龄幼虫肠道可培养细菌，共分离鉴定出10株细菌，变形菌门和厚壁菌门为斜纹夜蛾肠道可培养细菌中的优势菌群，其中肠杆菌属能降解纤维素，有助于昆虫的消化和营养吸收。江宇航等（2020b）证明从马尾松毛虫幼虫中分离的葡萄球菌属和芽孢杆菌属产生细胞素，对病原菌有抑制作用，参与昆虫免疫。另外，芽孢杆菌属也能产生抗生素、纤维素酶、细胞壁降解酶、蛋白酶和脂肪酶等，这有助于昆虫的消化和免疫作用（周艳玲等，2017）。思茅松毛虫1龄幼虫作为卵转变为虫的第一个时期，其肠道菌落组成、结构和多样性最丰富，有助于1龄幼虫快速地吸取营养，适应外界环境。思茅松毛虫从4龄幼虫开始迅速生长发育，取食量迅速增加，需要吸收大量的营养维持生长并准备越冬，其肠道细菌以芽孢杆菌属的数量最多，这个时期也是思茅松毛虫防治的关键龄期。克雷伯氏菌属具有较强的水解能力和耐药性，能降解甘蔗渣和其他甘蔗残余废物从而为机体提供营养，并抵御化学药剂的侵害，参与昆虫的生长和免疫（Dantur et al.，2015;汤纯等，2019;张聪等，2020）。7龄幼虫作为幼虫的最后一个时期，其取食量最大，需要吸收大量的营养来维持最后转变为茧的过程，所以此时的肠道细菌优势菌属为雷伯氏菌属和肠杆菌属。因此，思茅松毛虫1龄幼虫和7龄幼虫肠道细菌群落和数量变化对于思茅松毛虫整个生长发育具有承前启后的关键性作用。本研究仅对思茅松毛虫1、4和7龄幼虫肠道可培养细菌进行了研究，一些不可培养或特定的细菌需要结合高通量技术（Wooley et al.，2010;Long et al.，2015）和其他特定培养基做进一步研究。

昆虫与肠道微生物在生长过程中已形成了一个联系紧密的群体，二者互利共生。探索思茅松毛虫幼虫肠道微生物群落组成和结构，有助于对思茅松毛虫的生物群落管理和补充昆虫微生物资源库打下基础。

4 结论

思茅松毛虫1、4和7龄幼虫肠道可培养细菌群落组成和结构丰富，其中1龄幼虫的肠道优势菌属为葡萄球菌属、肠杆菌属和芽孢杆菌属，4龄幼虫肠道优势菌属为芽孢杆菌属，7龄幼虫的肠道优势细菌属为克雷伯氏菌属和肠杆菌属。

参考文献：

白林喜，王绍景，荣昌鹤. 2016. 思茅松毛虫的发生特点及综合治理[J]. 现代农业科技，（2）：155-157. [Bai L X，Wang S J，Rong C H. 2016. Occurrence characteristics and comprehensive control of Dendrolimus kikuchii[J]. Mo-dern Agricultural Science and Technology，（2）：155-157.]

程克华. 2018. 思茅松毛虫的发生及综合防治[J]. 现代农业科技，（9）：159. [Cheng K H. 2018. Occurrence and comprehensive control of Dendrolimus kikuchii[J]. Modern Agricultural Science and Technology，（9）：159.]

邓秀明. 2002. 复合生物杀虫剂防治思茅松毛虫的初步研究[J]. 福建林业科技，29（3）：33-36. doi：10.13428/j.cnki.fjlk.2002.03.009. [Deng X M. 2002. Preliminary study on using compound biological insecticides to control Dendrolimus kikuchii[J]. Journal of Fujian Forestry Science and Technology，29（3）：33-36.]

杜慧民，李文彬，刘润进. 2020. 昆虫共生细菌研究进展[J]. 环境昆虫学报，42（3）：615-629. doi：10.3969/j.issn.1674-0858.2020.03.13. [Du H M，Li W B，Liu R J. 2020. Recent advances in the study of insect symbiotic bacteria[J]. Journal of Environmental Entomology，42（3）：615-629.]

高珊珊. 2018. 三种鳞翅目玉米穗虫幼虫肠道细菌多样性研究[D]. 泰安：山东农业大学. [Gao S S. 2018. Diversity of intestinal bacteriae in three lepidopteran larvae dama-ging maize ears[D]. Taian：Shandong Agricultural University.]

何歡. 2019. 大蜡螟附生微生物多样性研究[D]. 贵阳：贵州大学. [He H. 2019. A study on epiphytic microbial diversity of Galleria mellonella[D]. Guiyang：Guizhou University.]

侯陶谦. 1987. 中国松毛虫[M]. 北京：科学出版社：32-34. [Hou T Q. 1987. The pine caterpillars in China[M]. Beijing：Science Press：32-34.]

江宇航，李宏伟，蔡赛波，林连兵，张棋麟. 2020a. 马尾松毛虫肠道细菌的分离鉴定与产蛋白酶细菌的筛选[J]. 浙江农业学报，32（8）：1446-1456. doi：10.3969/j.issn.1004-1524.2020.08.15. [Jiang Y H，Li H W，Cai S B，Lin L B，Zhang Q L. 2020a. Isolation and identification of intestinal culturable bacteria of Dendrolimus punctatus and screening of protease-producing bacteria[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis，32（8）：1446-1456.]

江宇航，李宏伟，杨晓洁，林连兵，张棋麟. 2020b. 马尾松毛虫肠道产细菌素细菌的筛选及抑菌特性[J/OL]. 微生物学通报. doi：10.13344/j.microbiol.china.200127. [Jiang Y H，Li H W，Yang X J，Lin L B，Zhang Q L. 2020b. Screening and antibacterial activity of bacteriocin-produ-cing bacteria in intestine of Dendrolimus punctatus[J/OL]. Microbiology China.]

李和爽. 2019. 松树赤松毛虫的发生与防治[J]. 农业科技与装备，（3）：14-15. doi： 0.16313/j.cnki.nykjyzb.2019.03. 006. [Li H S. 2019. Occurrence and control of Dendrolimus spectabilis[J]. Agricultural Science & Technology and Equipment，（3）：14-15.]

李清. 2015. 宁洱县那柯里村景观特色研究[D]. 昆明：西南林业大学. [Li Q. 2015. Stuay on the ladscape characte-ristic of Nakell Village from Ninger County[D]. Kunming： Southwest Forestry University.]

梁立明. 2018. 应用质型多角体病毒防治赤松毛虫林间试验[J]. 辽宁林业科技，（4）：30-31. [Liang L M. 2018. An interforest experiment on the control of Dendrolimus specta-bilis by Cytoplasmic polyhe drosis virus[J]. Journal of Liaoning Forestry Science & Technology，（4）：30-31.]

马艳芳，陈升富，王金华，李彪，熊智，张武先. 2012. 思茅松毛虫7龄幼虫肠道好氧细菌的筛选及毒力测定[J]. 中国森林病虫，31（1）：1-4. [Ma Y F，Chen S F，Wang J H，Li B，Xiong Z，Zhang W X.2012. Screening and virulence of intestinal aerobic bacteria from the 7th instar larvae of Dendrolimu kikuchii[J]. Forest Pest and Disease，31（1）：1-4.]

蒙蒙. 2012. 安宁河谷地域性气候特征及其对民族习俗文化的影响[J]. 西昌学院学报（自然科学版），26（2）：57-60. [Meng M. 2012. Affects of the regional climate characteristics of the Anning River Valley to the culture of natio-nal customs[J]. Journal of Xichang College（Natural Science Edition），26（2）：57-60.]

聂中良，熊智，王金华，陈晓溪，张珊，熊忠平. 2019. 思茅松毛虫的形态特征观察[J]. 西南大学学报（自然科学版），41（7）：15-20. doi：10.13718/j.cnki.xdzk.2019.07.003. [Nie Z L，Xiong Z，Wang J H，Chen X X，Zhang S，Xiong Z P. 2019. Observation of morphological characteristics of Dendrolimus kikuchii[J]. Journal of Southwest University（Natural Science Edition），41（7）：15-20.]

苏有顺. 2016. 大朝山东镇思茅松毛虫的危害及防治措施[J]. 绿色科技，（3）：59-60. doi：10.16663/j.cnki.lskj.2016. 03.028. [Su Y S. 2016. The harm and control measures of Dendrolimus kikuchii the east town of Dachaoshan[J]. Journal of Green Science and Technology，（3）：59-60.]

孙博通，蓝波妙，王倩，夏晓峰，尤民生. 2017. 斜纹夜蛾幼虫肠道细菌分离鉴定及其功能初步分析[J]. 生物资源，39（4）：264-271. doi：10.14188/j.ajsh.2017.04.005. [Sun B T，Lan B M，Wang Q，Xia X F，You M S. 2017. Isolation and preliminary functional analysis of the larval gut bacteria from Spodoptera litura[J]. Biotic Resources，39（4）：264-271.]

孫佑赫，熊智，王金华，张武先，王海林. 2012. 思茅松毛虫四龄幼虫肠道好氧细菌的ARDRA分析及鉴定[J]. 应用昆虫学报，49（6）：1618-1622. [Sun Y H，Xiong Z，Wang J H，Zhang W X，Wang H L. 2012. Amplified ribosomal DNA restriction analysis and identification of intestinal aerobic bacteria from 4th instar larva of Dendrolimu kikuchii[J]. Chinese Journal of Applied Entomology，49 （6）：1618-1622.]

汤纯，史云娇，卞欢，孙芝兰，刘芳，朱云龙. 2019. 食源性克雷伯氏菌的分离鉴定与生物膜形成特性[J]. 江苏农业学报，35（5）：1216-1221. doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2019. 05.031. [Tang C，Shi Y J，Bian H，Sun Z L，Liu F，Zhu Y L. 2019. Isolation，identification and biofilm formation characteristics of Klebsiella species in fresh duck blood[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，35（5）：1216-1221.]

王金昌，曾小琴，占智高，关丽梅，靳亮. 2017. 甘南尕海草原毛虫肠道细菌群落结构分析[J]. 江西科学，35（1）：5-11.  doi：10.13990/j. issn1001-3679.2017.01.002. [Wang J C，Zeng X Q，Zhan Z G，Guan L M，Jin L. 2017. Bacterial community composition of Gynaephora aureate Ghou et Yings midgut in Gannan Gahai[J]. Jiangxi Science，35（1）：5-11.]

王蕊蕊，胡颖，杨振德，郭春晖，朱林慧，郑霞林，玉舒中. 2018. 桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内可培养细菌分离鉴定及多样性分析[J]. 南方农业学报，49（12）：2432-2439. doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2018.12.12. [Wang R R，Hu Y，Yang Z D，Guo C H，Zhu L H，Zheng X L，Yu S Z. 2018. Isolation，identification and diversity of cultu-rable bacteria in female adults of Leptocybe invasa Fisher & La Salle[J]. Journal of Southern Agriculture，49（12）：2432-2439.]

王莹. 2020. 东方菜粉蝶肠道内生菌群多样性研究[D]. 上海：上海师范大学. [Wang Y. 2020. Study on the diversity of symbiotic bacteria of Pieris canidia[D]. Shanghai： Shanghai Normal University.]

王寅威，姜素贞，郑春仙，周庆仙，张英龙，姜方正. 1999. 松毛虫所致眼部损伤的研究[J]. 中华眼外伤职业眼病杂志，21（3）：187-188. [Wang Y W，Jiang S Z，Zheng C X，Zhou Q X，Zhang Y L，Jiang F Z. 1999. Research on ocular injury caused by Dendrolimus[J]. Chinese Journal of ocular trauma and occupational eye disease，21（3）：187-188.]

相辉，李木旺，赵勇，赵立平，张月华，黄勇平. 2007. 家蚕幼虫中肠细菌群落多样性的PCR-DGGE和16S rDNA文库序列分析[J]. 昆虫学报，50（3）：222-233. doi：10.16380/j.kcxb.2007.03.003. [Xiang H，Li M W，Zhao Y，Zhao L P，Zhang Y H，Huang Y P. 2007. Bacterial community in midguts of the silkworm larvae estimated by PCR/DGGE and 16S rDNA gene library analysis[J]. Acta Entomolo-gica Sinica，50（3）：222-233.]

熊忠平，聂忠良，熊智. 2018. 一种思茅松毛虫饲养方法：CN108770790A[P]. 2018-11-09. [Xiong Z P，Nie Z L，Xiong Z. 2018. A feeding method of Dendrolimus kikuchii：CN108770790A[P]. 2018-11-09.]

杨云秋，张勇，陈亦然，张灿，赵天宇，龙雁华. 2018. 昆虫肠道细菌的功能和研究方法[J]. 安徽农业大学学报，45（3）：512-518. doi：10.13610/j.cnki.1672-352x.20180619.007. [Yang Y Q，Zhang Y，Chen Y R，Zhang C，Zhao T Y，Long Y H. 2018. Function and research methods of insect intestinal bacteria[J]. Journal of Anhui Agricultural University，45（3）：512-518.]

余仲東，唐光辉，曹支敏. 2016. 陕西小叶杨叶内生真菌群体多样性和结构特征[J]. 林业科学，52（6）：86-92.  doi：10.11707/j.1001-7488.20160610. [Yu Z D，Tang G H，Cao Z M. 2016. Diversity and community structure of endophytic fungi in the leaves of Populus simonii in Shanxi Province[J]. Scientia Silvae Sinicae，52（6）：86-92.]

张聪，肖亦辰，陈怀君，袁敬知，韦德源，王晓晔. 2020. 伴侣动物源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及毒力和耐药性分析[J].中国畜牧兽医，47（5）：1583-1592. doi：10.16431/j.cnki.1671-7236.2020.05.033. [Zhang C，Xiao Y C，Chen H J，Yuan J Z，Wei D Y，Wang X Y. 2020. Isolation，identification and analysis of virulence and drug resistance of Klebsiella pneumoniae from companion animals[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，47（5）：1583-1592.]

张珊，熊忠平，张俊，聂中良，陈晓溪，凌溪，熊智. 2019. 思茅松毛虫肠道真菌分离鉴定及水解酶活性初步研究[J]. 环境昆虫学报，41（2）：413-419. doi：10.3969/j.issn.1674-0858.2019.02.26. [Zhang S，Xiong Z P，Zhang J，Nie Z L，Chen X X，Ling X，Xiong Z. 2019. Isolation and identification of intestinal fungi in the larvae of Dendrolimus kikuchii Matsumura and their hydrolase activity[J]. Journal of Environmental Entomology，41（2）：413-419.]

张志红，张凌英，赵英杰，苏造堂，陈思颖，肖关丽，李维薇，陈斌. 2020. 云南省芒市草地贪夜蛾幼虫肠道可培养细菌种类及对抗生素的敏感性[J]. 南方农业学报，51（6）：1293-1299. doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2020.06.007. [Zhang Z H，Zhang L Y，Zhao Y J，Su Z T，Chen S Y，Xiao G L，Li W W，Chen B. 2020. Species and antibiotic sensitivity of culturable gut bacteria of Spodoptera frugiperda larvae from Mangshi，Yunnan[J]. Journal of Sou-thern Agriculture ，51（6）：1293-1299.]

张振宇，圣平，黄胜威，赵永顺，张宏宇. 2017. 昆虫肠道微生物的多样性、功能及应用[J]. 生物资源，39（4）：231-239. doi：10.14188/j.ajsh.2017.04.001. [Zhang Z Y，Sheng P，Huang S W，Zhao Y S，Zhang H Y. 2017. Diversity，function and application of insect gut microbiota[J]. Biotic Resources，39（4）：231-239.]

赵佳. 2020. 落叶松毛虫对林木的危害及防治措施[J]. 農业与技术，40（8）：81-82. doi：10.19754/j. nyyjs.20200430029. [Zhao J. 2020. The harm of Dendrolimus superans to trees and its control measures[J]. Agriculture and Technology，40（8）：81-82.]

郑梅霞，朱育菁，刘波，王阶平，陈峥，潘志针，刘国红. 2019. 云南苍山芽胞杆菌多样性研究[J]. 福建农业学报，34（1）：104-116. doi：10.19303/j.issn.1008-0384.2019.01. 015. [Zheng M X，Zhu Y J，Liu B，Wang J P，Chen Z，Pan Z Z，Liu G H. 2019. Microbial diversity of Bacillus community in soils at Cangshan，Yunnan[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences，34（1）：104-116.]

周俊华，王银臣，万一琳，胡基华，孙凡. 2020. 树干阻隔器阻隔防治榆紫叶甲及落叶松毛虫的效果[J]. 东北林业大学学报，48（7）：120-122. doi：10.13759/j.cnki.dlxb.2020. 07.023. [Zhou J H，Wang Y C，Wan Y L，Hu J H，Sun F. 2020. Control of Ambrostoma quadriimpressum and Dendrolimus superans by using trunk barrier[J]. Journal of Northeast Forestry University，48（7）：120-122.]

周艳玲，王一丁，宋清姿，肖云星，刘金岚，袁向华. 2017. 峨眉山大蚯蚓肠道可培养细菌多样性研究[J]. 生命科学研究，21（3）：220-227. doi：10.16605/j.cnki.1007-7847.2017. 03.006. [Zhou Y L，Wang Y D，Song Q Z，Xiao Y X，Liu J L，Yuan X H. 2017. Diversity research on culturable bacteria in the intestinal tract of earthworms in Mount Emei[J]. Life Science Research，21（3）：220-227.]

Dantur K I，Enrique R，Welin B，Castagnaro A P. 2015. Isolation of cellulolytic bacteria from the intestine of Diatraea saccharalis larvae and evaluation of their capacity to degrade sugarcane biomass[J]. AMB Express，5：15. doi： 10.1186/s13568-015-0101-z.

Long L L，Guo J J，Li P，Guo Y D. 2015. Bacterial diversity in Bercaea cruentata gut described using high-throughput sequencing[J]. Forensic Science International：Genetics Su-pplement Series，5：479-481.doi： 10.1016/j.fsigss.2015. 09.190.

Philipp P E，Moran N A. 2003. The gut microbiota of insects–diversity in structure and function[J]. Fems Microbiology Reviews，（5）：699-735. doi：10.1111/1574-6976.12025.

Russo M L，Pelizza S A，Cabello M N，Stenglein S A，Scorsetti A C. 2015. Endophytic colonisation of tobacco，corn，wheat and soybeans by the fungal entomopathogen Beauveria bassiana（Ascomycota，Hypocreales）[J]. Biocontrolence & Technology，25（4）：475-480. doi： 10.1080/095 83157. 2014.982511.

Wooley J C，Godzik A，Friedberg I. 2010. A primer on metagenomics[J]. PLoS Computational Biology，6（2）：e1000 667. doi：10.1371/journal.pcbi.1000667.

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