HPLC-MS/MS法鉴别中药制剂中6种合成色素的方法研究〔1〕

任荣军，卢大良，李慧敏，欧阳毅

(岳阳市检验检测中心，湖南 岳阳 414000)

药品生产中色素的使用应符合国家药品管理部门的有关规定，中药材和中药饮片不应使用色素[1]。由于利益的驱使，中药材的非法染色行为屡禁不止，甚至同时使用多种色素染色，严重影响中药产业的健康发展，也严重危害人民的身体健康。目前，色素的检测方法主要有分光光度法、微柱法、极谱法、紫外吸收光谱法、高效液相色谱法、高效液相串联质谱法等[2]。本文建立了HPLC-MS/MS法快速测定中药制剂中6种合成色素，方法快捷、简单，专属性较强，可为检测中药制剂中非法添加色素提供可靠的技术支撑。报告如下。

1 仪器与试验药品

1.1 仪器

Waters 2695e/2489高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器(Waters公司)；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；岛津LCMS-8050高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源(ESI)。

1.2 试验药品

金橙Ⅱ(111769-201302)、日落黄(510005-201602)、孔雀石绿(520063-201501)、碱性橙Ⅱ(510080-201401)、金胺O(111770-201603)均购自中国食品药品检定研究院；亮黄(GRN-966714，美国进口)；黄连上清丸(太极集团重庆中药二厂有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯)；试验用水为超纯水；其余化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Shim-packGiss(50mm×2.1mm，1.9 μm)；流动相：乙腈(A)-0.02 mol/L乙酸铵溶液(B)，梯度洗脱(0～20min，A2%→50%；20～25min，A50%；25～30min，A50%→70%；30～35 min，A 70%)；流速为0.3 mL/min。

2.2 质谱条件

电离模式：孔雀石绿采用正离子源电离模式(ESI+)，其余色素均采用负离子源电离模式(ESI-)，全扫描一级质谱，选择离子二级扫描质谱检测方式；雾化气：3 L/min，干燥气：10 L/min，加热气：10 L/min，均为高纯氮气；加热气温：300 ℃，加热块温度：400 ℃，脱溶剂管温度：250 ℃；毛细管电压：3.5 kV。

2.3 溶液的制备

混合对照试剂溶液的制备：分别取日落黄、金胺O、亮黄、金橙Ⅱ、碱性橙Ⅱ、孔雀石绿对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.05 μg混合对照试剂溶液，即得。供试品溶液的制备：以黄连上清丸为基质，取适量，研细，取约3.0 g(1次服用量)，精密称定，置具塞锥形瓶中，取上述混合对照试剂浓溶液5 mL，充分吸附后，挥干溶剂，精密加入甲醇25 mL，超声处理(250 W，40 kHz)15 min，放冷，离心，取上清液以四氟乙烯滤膜滤过，即得。

2.4 各化合物标准谱库信息

精密量取“2.3”项下对照品溶液各10 μL，按“2.1”及“2.2”项下色谱及质谱条件进样，对混合对照品溶液进行HPLC-MS/MS分析，得到各化合物母离子，并对母离子进行二级扫描得到主要子离子(见图1和图2)，并建立各色素标准谱库信息，同时取各对照品溶液，逐级稀释后测定，以S/n=3计算最低检测限(见表1)。

图1 混合对照品一级质谱

表1 标准谱库信息

2.5 专属性试验

黄连上清丸处方中包含有黄连、黄芩、黄柏、大黄等几味常见黄色染色饮片，以该中成药作为研究基质，考察加入色素混合对照品溶液后，制剂中其他成分及辅料对检测方法的干扰情况，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，同时不加混合对照品溶液制备空白基质溶液，比较液相色谱图与质谱图。结果显示，空白基质溶液中液相色谱图没有与混合对照品溶液相同的色谱峰(见图3和图4)，而加混合对照品溶液制备的供试品溶液，均能检测到与混合对照品溶液相同的母离子峰及子离子峰，因此判断该制剂所含中药成分及辅料对结果无干扰。

A为金橙Ⅱ，B为碱性橙Ⅱ，C为日落黄，D为金胺O，E为亮黄，F为孔雀石绿；横坐标为质荷比(m/Z)，纵坐标为丰度(%)

1为日落黄，2为亮黄，3为金橙Ⅱ，4为金胺O，5为碱性橙Ⅱ，6为孔雀石绿

图4 样品色谱图

2.6 样品测定

利用本方法对市售的25份中药制剂进行6种合成色素的测定，结果均未检出目标分析物。

3 讨 论

3.1 测定方法的选择

笔者采用高效液相色谱法同时检测多个色素，能有效分离各组分，但部分中药制剂本身基质会对色谱峰有不同程度的干扰，影响该方法的通用性。在基质有干扰或同时检测更多种色素时，采用液质联用等技术，可防止假阳性结果的出现，保证测定结果准确可靠[3]。

3.2 基质的选择

本研究中，在没有阳性样品的前提下，基质的选择主要以中药处方中是否包含有常见的染色饮片为依据，考虑到方法的通用性，尽量选择多个剂型(包括丸剂、片剂和胶囊剂等)作为基质。本文选择黄连上清丸作为基质，处方中包含有黄连、黄芩、黄柏、大黄等几味常见染色品种，且均以原粉入药，基本符合试验的要求。合成色素为弱酸性化合物时，适合于负离子扫描模式[4]，偏碱性色素则宜采用正离子扫描模式。本文中孔雀石绿为弱碱性化合物，在负离子扫描模式下检测不到准分子离子峰，选择正离子扫描模式，在不接色谱柱的条件下进行母离子全扫描，确定了准分子离子峰。本文建立了6种色素的HPLC-MS/MS检测方法，得到了标准谱库信息，数据库的使用达到了预期目标，节省了试验时间，降低了试验成本，尤其适用于大数量检品的快速筛查，为打击中成药中非法添加色素的制假掺伪行为提供了一定技术支撑。