滇牡丹环阿屯醇合成酶基因的克隆及表达分析

李云琴 原晓龙 陈中华 王毅

摘 要： 为研究环阿屯醇合成酶（cycloartenol synthase）基因在滇牡丹生物合成中的作用机制，该文采用RT-PCR技术首次从滇牡丹（Paeonia delavayi）中克隆得到一个具完整开放阅读框的环阿屯醇合成酶基因（PdCAS），该基因全长2 274 bp，共编码757个氨基酸，PdCAS蛋白序列与桃（Prunus persica）、日本裸樱（Prunus yedoensis var. nudiflora）、葡萄（Vitis vinifera）蛋白序列相似性在86%以上。序列比对分析显示PdCAS具有氧化鲨烯环化酶超家族典型的DCTAE结构域和三萜合成酶的标志性序列DGSWYGSWGVCFTYG。滇牡丹PdCAS蛋白与蔷薇科植物苹果（Malus domestica XP 008391430.1）、白梨（Pyrus bretschneideri XP 009370034.1）、月季（Rosa chinensis XP 024193310.1）、日本裸樱（Prunus yedoensis var. nudiflora PQQ11009.1）、桃（Prunus persica XP 007225240.1）的CAS蛋白聚为一类。PdCAS基因在滇牡丹各组织中均有表达，但是在花瓣中表达量较高。该研究克隆的PdCAS基因与滇牡丹甾醇类化合物的合成密切相关。

关键词： 滇牡丹， 环阿屯醇合成酶， cDNA克隆， 基因功能分析

中图分类号： Q943

文献标识码： A

文章编号： 1000-3142（2021）04-0567-06

Abstract： To study the effect of cycloartenol synthase gene （CAS） in the sterol biosynthesis of Paeonia delavayi， using the RT-PCR technology， a complete open reading frame of PdCAS gene was cloned from Paeonia delavayi for the first time. The full-length cDNA of PdCAS gene was 2 274 bp， encoded 757 amino acids. The PdCAS protein sequence of P. delavayi had more than 86% similarty with the Prunus persica， Prunus yedoensis var. nudiflora and Vitis vinifera. Sequence alignment analysis showed that PdCAS had a typical conserved DCTAE motif of oxidosaualene cyclase and the marker sequence DGSWYGSWGVCFTYG of triterpenoid synthase. The phylogenetic analysis revealed that PdCAS clustered together with CAS proteins of Malus domestica （XP 008391430.1）， Pyrus bretschneideri （XP 009370034.1）， Rosa chinensis（XP 024193310.1）， Prunus yedoensis var. nudiflora（PQQ11009.1） and Prunus persica （XP 007225240.1）. PdCAS expressed significantly in different tissues and had the highest transcript profile in flowers. PdCAS was closely related to the synthesis of sterols from Paeonia delavayi.

Key words： Paeonia delavayi， cycloartenol synthase（CAS）， cDNA clone， gene function analysis

環阿屯醇（cycloartenol） 为植物甾醇类化合物，广泛分布于植物中。近年来研究发现环阿屯醇具有明显的抗炎（Akihisa et al.，2000）、抗氧化（Islam et al.，2009）、抗肿瘤（Prakash et al.，2004）、调节胆固醇（Fukuoka et al.，2014）等药理活性;它还是重要的药物中间体和先导化合物，是菜油甾醇（campesterol）等植物甾醇及甾体皂苷等化合物生物及半化学合成的关键前体物质（张忠廉等，2017）。环阿屯醇的含量高低决定了植物甾醇类化合物的生物合成效率;此外，环阿屯醇对植物的生长发育具有显著影响（Gas-Pascual et al，2014）。

环阿屯醇合成酶（cycloartenol synthase，简称 CAS）属 于 氧 化 鲨 烯 环 化 酶（oxido squalene cyclase，OSC）家族，该合成酶基因是合成环阿屯醇和合成植物甾醇及甾体类物质的关键调控基因（张忠廉等，2017;刘梦迪等，2019）。目前，已有 20多种植物的CAS基因被分离和克隆出来，如刺五加（Eleutherococcus senticosus）（邢朝斌等，2012）、丹 参（Salvia miltiorrhiza）（李珍等，2013）和黄芪（Astragalus membranaceus）（Chen et al.，2015）等，有些还通过异源表达进行了功能验证。但是至今未见到关于滇牡丹（Paeonia delavayi）环阿屯醇合成酶基因的相关研究。

滇牡丹（Paeonia delavayi）是芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia）植物。芍药属植物根皮是一种传统中药材，通常称其为“牡丹皮”或者“丹皮”，所含主要有效成分为酚类（如丹皮酚）、萜类、苷类（如芍药苷）、鞣质等，具有抗凝血、降压、抗炎、抑制中枢神经系统等功能。作为芍药属的一个牡丹类群，滇牡丹也被视为一种民族药材被广泛使用，其根皮具有抗菌活性， 可用于镇痛、镇静、抗炎及女性疾病的治疗（Wu et al.，2002）。

本研究在滇牡丹转录组测序的基础上，成功克隆得到滇牡丹环阿屯醇合成酶（CAS）基因，并进行生物信息学分析、系统进化树构建及表达分析，为进一步研究环阿屯醇合成酶基因在滇牡丹中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

滇牡丹（Paeonia delavayi）种植于云南省林业科学院苗圃基地。采集滇牡丹的根、茎、叶、种子、花蕊、花芽（花完全被花萼包裹）、花蕾（露出花瓣）及花开（花瓣全部展开）、花谢（花瓣开始枯萎）时期的花瓣，立即用液氮冷冻保存。

1.2 RNA提取与cDNA合成

先用植物总RNA 提取试剂盒提取滇牡丹根、茎、叶、种子及各发育期花的总RNA;然后再用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳完成RNA质量检测，用NanoDropTM 2000检测RNA浓度;再反转录成cDNA，保存于-20 ℃冰箱中备用。

1.3 PdCAS基因的克隆

采用仙客来（Cyclamen persicum）的CAS基因为模板，BLAST搜索滇牡丹花瓣的转录组数据，得到滇牡丹的环阿屯醇合成酶基因（PdCAS）的cDNA序列，以该序列为基础，设计含有起始密码子和终止密码子的特异引物（PdCAS1F： 5′-ATGTGGAAGCTGAAGATCGC-3′和PdCAS1R： 5′-TCAGGAGACTTGCAATACCC-3′）。用滇牡丹花瓣cDNA为模板，PdCAS1F和PdCAS1R为引物，以EasyPfu DNA聚合酶扩增得到PdCAS全基因片段。经过电泳检测后将目的片段连接到pGMT载体上，经PCR检测，送往上海生工进行测序。

1.4 PdCAS基因蛋白序列分析

先获得滇牡丹PdCAS基因cDNA序列，利用NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上的ORF Finder （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/） 分析获得其蛋白氨基酸序列，并用ProParam预测其蛋白的理化性质;然后通过NCBI对环阿屯醇合成酶PdCAS基因的蛋白氨基酸序列进行搜索，选择与PdCAS蛋白序列同源性较高的植物环阿屯醇合成酶蛋白序列;再用MEGA 6.0构建系统进化树。

1.5 PdCAS基因在不同器官上的表达分析

用植物总RNA 提取试剂盒提取滇牡丹各器官、各发育时期的花和不同颜色花瓣的总RNA，用琼脂糖凝胶电泳和NanoDropTM 2000 分别测定RNA 的质量和浓度后，进行反转录合成cDNA 的第一条链。以特异引物TPdCAS F （5′-TTGAGAGAGAAGGCTCTTCG-3′）和TPdCAS R（5′-TCGATGAACATAGCAGCTCT-3′）检测滇牡丹PdCAS基因在根、茎、叶、花瓣等不同器官中的表达情况。经过琼脂凝胶电泳的检测后，利用GENE-SNAPS图像分析软件分析PdCAS基因积分吸光度，进行相对定量表达分析。

2 结果与分析

2.1 RNA提取和PdCAS基因克隆

参照植物总RNA提取试剂盒说明书提取滇牡丹花瓣及其他器官的总RNA，然后反转录成cDNA第一条链，保存备用。以含有起始密码子的PdCAS1F和终止密码子的PdCAS1R作为引物，滇牡丹花瓣cDNA为模板，用EasyPfuDNA聚合酶扩增获得cDNA片段，电泳检测后，将获得目的片段连接到克隆载体上，28 ℃条件下培养过夜，并转化进感受态细胞DH5α中，菌落PCR检测后送华大基因测序公司测序。最终获得全长2 274 bp的滇牡丹CAS基因编码区全长cDNA，并命名为PdCAS，共编码757个蛋白氨基酸（图1）。

2.2 滇牡丹PdCAS基因蛋白序列分析

用在线程序ORF Finder预测PdCAS基因的开放阅读框，ProParam预测PdCAS基因的理化性质。结果显示：该蛋白由757个氨基酸组成，其分子量为86 117.2 Da，等电点为6.12。用推断得到的757个氨基酸序列与已知的其他植物CAS蛋白序列进行相似性对比发现，滇牡丹PdCAS蛋白序列与桃（Prunus persica）CAS蛋白序列相似性为86.66%;与日本裸樱（Prunus yedoensis var. nudiflora）CAS蛋白序列相似性为86.66%;与葡萄（Vitis vinifera）CAS蛋白序列相似性为86.49%。对滇牡丹PdCAS蛋白序列分析发现，PdCAS编码的蛋白具有1个氧化鲨烯环化酶超家族典型的DCTAE结构域（Poraiia et a1.，1994），1个三萜合成酶的标志性序列DGSWYGSWGVCFTYG（邢朝斌等，2012）（图2）。

为研究滇牡丹在分子水平的进化地位和与其他植物种的亲缘关系，将推导出来的PdCAS蛋白序列在美国国家生物技术信息中心（NCBI）进行比对，得到其他植物CAS蛋白序列，用MEGA 6.0中自带的Cluster W进行蛋白序列多重比对后，用Neighbor-joining算法（自检举1 000次），绘制出滇牡丹PdCAS与其他植物的CAS蛋白的进化树（图3）。结果显示，滇牡丹PdCAS蛋白与蔷薇科植物苹果（Malus domestica XP 008391430.1）、白梨（Pyrus bretschneideri XP 009370034.1）、月季（Rosa chinensis XP 024193310.1）、日本裸樱（Prunus yedoensis var. nudiflora PQQ11009.1）、桃（Prunus persica XP 007225240.1 ）的CAS蛋白聚為一类（图3）。

2.3 滇牡丹PdCAS基因的轉录模式分析

采集滇牡丹的根、茎、叶、种子、各时期花瓣等器官，用植物总RNA提取试剂盒说明书提取滇牡丹各时期花瓣以及各器官的总RNA并反转录成cDNA。用特异引物PdCAS1F和PdCAS1R检测不同时期的花瓣、花蕊及根、茎、叶、种子中PdCAS基因表达的具体情况（图4）。结果显示，PdCAS基因在滇牡丹根、茎、叶、种子、花蕊及各时期花瓣中都有表达，但是在各时期花瓣、花蕊中表达量较高，其中以花谢时期的花瓣中表达量最高。

3 讨论与结论

CAS是引导类异戊二烯代谢途径流向甾醇类化合物的关键基因（Kim et al.，2005），分析其在各器官中的表达量变化情况，可了解对甾醇合成的影响。RT-PCR 结果表明，PdCAS基因在不同时期的花、种子、叶、茎和根中都有表达，这与盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis）（涂碧梦等，2010）和刺五加（Acanthopanax senticosus）（邢朝斌等，2012）中CAS基因的的表达特点类似，均具有组成型表达的特点。PdCAS在滇牡丹根、茎、叶、花、种子中都有表达，还证明了该基因的表达存在普遍性。滇牡丹 CAS 在各器官表达量差异相对较大，花瓣中表达量较高，而在根茎中表达量较低;最大值出现在花谢授粉后1 d的花瓣中，最小值出现在茎中。

本研究中，PdCAS基因表达量在繁殖器官中最高，虽然在根、茎中表达量很低，但是也有表达。PdCAS在根中有表达说明环阿屯醇的衍生物在根中存在。Wu et al.（2002）认为滇牡丹作为一种药材，主要是利用其根皮，如果环阿屯醇及衍生物是丹皮的主要活性成分，那么，花、叶、茎，也可以起到根的药用效果。花和叶虽然表达量高，但是物质累积量并不一定比根高，因为花会凋谢，树叶会掉落，而滇牡丹的根作为存储器官，经过长年的累积，表达量虽然低，但是活性物质的含量未必少于花瓣。

本研究所克隆的滇牡丹 PdCAS 基因蛋白序列与蔷薇科植物如桃、苹果等的CAS 基因蛋白序列相似性≥80%，结构和蛋白序列上的一致性较高说明PdCAS基因比较保守。邢朝斌等（2012）已经在不同植物中分离得到了5 类鲨烯环化酶，即CAS、β-香树酯醇合成酶（β-amyrin synthase，β-AS）、达玛烷二醇合成酶（dammarenediol synthase）、羊毛甾醇合成酶（lanosterol synthase）和羽扇豆醇合成酶（lupeol synthase）。生物体内的三萜类物质和植物甾醇都源于同一前体物质—2，3-氧化鲨烯，且均由异戊二烯途径合成，2 ， 3-氧化鲨烯在上述5种环化酶的作用下生成植物甾醇和三萜类骨架。其中 CAS 主要功能是催化环化合成各种甾醇和类甾醇类化合物（明乾良等，2010），即2， 3-氧化鲨烯在CAS的作用下合成环阿屯醇， 再经过一系列的催化反应生成植物甾醇（该途径被称为“环阿屯醇途径”）（张忠廉等，2017）。本研究中PdCAS的蛋白序列中存在氧化鲨烯环化酶超家族的特征序列DCTAE， 也说明PdCAS基因属于鲨烯环化酶基因家族。DCTAE可以将鲨烯合酶的 DDTAV 定点突变成 DCTAE，致使鲨烯合酶的底物由鲨烯变成2， 3-氧化鲨烯（Dang&Prestwich， 2000）。因此，PdCAS基因与滇牡丹甾醇类化合物的合成密切相关。后续研究将对PdCAS和与之可能相关的P450进行异源表达试图得到新的环阿屯醇衍生物。

“环阿屯醇途径”是甾醇类化合物合成的主要途径（Gas-Pascual et al.，2014），该途径及环阿屯醇对植物的生长发育影响显著，但其具体的影响机制尚未得到深入研究。环阿屯醇还具多种药理活性，而具体作用机制尚未清楚。因此，今后应重视对其药理活性、生理作用和相关次生代谢产物的研究，为更好地研发和应用滇牡丹甾醇类化合物奠定基础。

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（责任编辑 李 莉）