硬脂酸单甘油酯协同卡泊芬净的体外抗念珠菌活性研究

邱丽娟 巢雯 石安喆 阎澜 吕权真 姜远英

(1. 海军军医大学基础医学院，上海 200433; 2. 海军军医大学药学院，上海 200433)

白念珠菌是与人类共生的机会性致病真菌，可以在正常人的皮肤、口腔、肠道等部位检出[1]。由于近年来HIV感染、免疫受损患者的增多以及免疫抑制剂的使用，念珠菌黏膜感染和侵袭性感染的发病率逐年攀升[2-4]。目前，念珠菌病可以用唑类、棘白菌素类、多烯类等抗真菌药物治疗，但令人担忧的是白念珠菌对这些常见的抗真菌药物的耐药性越来越高[5]，寻找具有协同抗真菌活性的化合物可以为解决真菌耐药问题提供重要方向[6]。

脂肪酸在调控细胞生命活动和微生物菌群平衡方面发挥重要作用。许多研究表明脂肪酸类物质具有抗疟疾、抗结核分枝杆菌以及抗真菌活性[7]。例如，2-己癸酸可以通过抑制胞内饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的合成以及抑制脂肪酸酰化发挥抗真菌作用。十四烷酸(14∶0)类似物可以竞争结合真菌的N-肉豆蔻酰基转移酶(N-myristoyltransferase, NMT)，干扰真菌的脂质代谢，进而抑制和杀灭真菌[8]。本研究发现含有21个碳的硬脂酸单甘油酯(glyceryl monostearate， GMS)与卡泊芬净联合用药后，显著增强了卡泊芬净的体外抗真菌效果，该研究为抗真菌药物增敏剂研究提供了新思路。此外，硬脂酸单甘油酯是一种常见的非离子表面活性剂，具有亲油性和消泡性，可以用于各种软膏、胶囊等药物的乳化剂，该研究也可以为卡泊芬净的剂型改造提供新的方向。硬脂酸单甘油酯结构式见图1。

图1 硬脂酸单甘油酯结构式

1 材料与方法

1.1 材料

洁净工作台(HPeafe-1200LC(A2)上海力申科学仪器有限公司)；振荡培养箱(HZ-2111K-B江苏太仓市实验设备厂)；微量加样器(Biohit)；小型冷冻离心机(HitachiCT15RE)；蒸汽灭菌锅(KG-SX500 KAGOSHIMA SELSAKUSYO Japan)；多功能酶标仪，TECAN Infinite M200)；倒置相差显微镜(Amersham Pharmacia AMG EVOS×1)；紫外分光光度计(Amersham Biosciences Mltrospec10)。

实验中用到的标准菌株白念珠菌SC5314由美国Georgetown大学William A Fonzi教授赠与，临床分离的氟康唑耐药白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌来自上海长海医院皮肤科，卡泊芬净(CAS)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，硬脂酸单甘油酯(GMS)购自上海生工生物科技有限公司，酵母提取物、甘露醇、营养肉汤购自BD公司，蛋白胨、葡萄糖、琼脂购自上海生工生物技术有限公司，RPMI 1640购自Gibco公司。

1.2 方法

棋盘式微量液基稀释法 ①菌株活化：将保存在SDA固体培养皿的念珠菌单克隆菌株转接到1 mL YEPD培养基，于培养箱(30℃、200 r/min)，培养16 h，使白念珠菌处于指数生长的平台期;②洗菌：将活化好的菌株转移到1.5 mL离心管中，用无菌PBS缓冲液洗3次，再用1 mL PBS重悬;③调节菌液浓度：先用RPMI 1640培养基稀释菌液至浓度为1×106～5×106CFU /mL，而后再用RPMI 1640培养基稀释1 000倍，使菌液终浓度为1×103～5×103CFU /mL;④GMS单药处理：取6个无菌的10 mL玻璃试管，1号试管中加入3 mL上述RPMI 1640稀释的菌液，并加GMS使得药物终浓度为4 μg/mL；2—6号试管中加入1.5 mL上述稀释的菌液；从1至6号试管做倍比稀释，使得药物终浓度分别为4 μg/ mL、2 μg/ mL，1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/ mL、0.125 μg/ mL；⑤制备药敏实验板：取一块96孔板，第1列加入100 μL RPMI 1640培养基做空白对照；第12列加入100 μL未加药处理的菌液做阳性对照；第2列从A—F行分别加入上述GMS单药处理的1—6号菌液200 μL，第3—11列从A—F行分别加入上述GMS单药处理的1—6号菌液100 μL，在第二列A—F行中再加入CAS使得药物终浓度为4 μg/mL；第2—11列G、H做单药处理对照，先分别加入未加药处理的菌液，其中第2列200 μL，第3—11列100 μL，第2列G行再加入CAS使得药物终浓度为4 μg/mL，第2列H行再加入GMS使得药物浓度为4 μg/mL。第2—11列进行倍比稀释，最终使得CAS终浓度分别为4 μg/ mL、2 μg/ mL，1 μg/ mL、0.5 μg/ mL、0.25 μg/ mL、0.125 μg/ mL，0.063 μg/ mL、0.031 μg/ mL、0.016 μg/ mL、0.008 μg/ mL，GMS终浓度分别为4 μg/ mL、2 μg/ mL，1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/ mL、0.125 μg/ mL；96孔板于30 ℃恒温培养24 h，用酶标仪在λ=600 nm处测OD值，计算MIC和FICI值(FICI=A药联用时的MIC/A药单用时的MIC+B药联用时的MIC/B药单用时的MIC)，两药合用评价标准：当FICI>4时两药产生拮抗作用；0.5

白念珠菌菌丝形成诱导实验 过夜活化的白念珠菌SC5314和904分别用Spider培养液和RPMI 1640培养液稀释1 000倍，加入CAS的终浓度为0.0313 μg/mL，而后加入GMS并进行倍比稀释，使GMS的终浓度为4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL，空白对照组加入同体积的DMSO，充分混匀，转移至12孔板中，37 ℃，静置培养3 h，倒置显微镜观察菌丝形态[10]。

2 结 果

2.1 硬脂酸单甘油酯与卡泊芬净具有显著的协同抗念珠菌活性

为了考察硬脂酸单甘油酯对白念珠菌药物敏感性的影响，我们在RPMI 1640培养基中，加入不同浓度的硬脂酸单甘油酯、卡泊芬净及氟康唑，结果表明加入1 μg/mL的硬脂酸单甘油酯后，白念珠菌标准菌株SC5314对卡泊芬净的敏感性增加了8倍(见表1)，两药具有明显的协同作用，但对氟康唑的敏感性并无明显影响(见表2)。之后，我们进一步考察了硬脂酸单甘油酯协同卡泊芬净的抗念珠菌谱，结果表明低浓度的硬脂酸单甘油酯可以协同卡泊芬净对临床分离的氟康唑耐药白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌产生协同抗菌作用，结果显示硬脂酸单甘油酯协同卡泊芬净对80%左右的临床致病念珠菌有协同抗真菌效果(见表1)。以上结果表明在常见的临床致病念珠菌中，硬脂酸单甘油酯可以协同卡泊芬净抑制念珠菌的生长。

表1 棋盘式微量稀释法检测硬脂酸单甘油酯(GMS)与卡泊芬净(CAS)合用对念珠菌的体外抗真菌活性

表2 棋盘式微量稀释法检测硬脂酸单甘油酯(GMS)与氟康唑(FCZ)合用对白念珠菌的体外抗真菌活性

2.2 硬脂酸单甘油酯可以协同卡泊芬净抑制白念珠菌的菌丝形成

为了进一步考察硬脂酸单甘油酯与卡泊芬净合用的体外抗菌效果，我们研究了两种化合物合用对白念珠菌菌丝生长的抑制作用。结果表明，在RPMI 1640和Spider液体培养基诱导菌丝形成的过程中，卡泊芬净抑制菌丝形成的最低浓度为0.0625 μg/mL，当我们合用4 μg/mL 的硬脂酸单甘油酯后，卡泊芬净在0.0313 μg/mL也能完全抑制白念珠菌的菌丝形成，这表明硬脂酸单甘油酯与卡泊芬净可以协同抑制白念珠菌的菌丝形成，具体结果见图2。

图2 RPMI1640和Spider培养基诱导白念珠菌菌丝形成。白念珠菌SC5314在37℃培养3 h，各孔中分别加入4 μg/mL GMS、0.0313 μg/mL CAS和4 μg/mL GMS+0.0313 μg/mL CAS

为了考察硬脂酸单甘油酯和卡泊芬净协同抑制菌丝的最低浓度，我们在Spider培养基中进一步降低了硬脂酸单甘油酯的浓度。结果显示，2 μg/mL的硬脂酸单甘油酯即可与0.0313 μg/mL的卡泊芬净产生协同效果，明显抑制Spider 培养基中液态菌丝的生长，见图3。

图3 Spider培养基诱导白念珠菌菌丝形成。白念珠菌SC5314在37℃培养3 h，各孔中分别加入0.0313 μg/mL CAS、1 μg/mL GMS+0.0313 μg/mL CAS、2 μg/mL GMS+0.0313 μg/mL CAS 和4 μg/mL GMS+0.0313 μg/mL CAS

3 讨 论

卡泊芬净是临床常用的抗念珠菌感染药物，由于其抗菌活性强、毒性低而被广泛使用[11]。然而，临床使用的卡泊芬净价格昂贵，使用成本较高，通过药物合用的方式降低其使用剂量可以显著减少患者的用药成本。同时，临床研究发现白念珠菌可以通过靶基因FKS1突变的方式对卡泊芬净耐受，而通过药物合用的方式也可以降低真菌耐药性的产生[5]。Lu等前期发现作用于卡泊芬净上游的香叶基转移酶抑制剂L-269289可以在体内外增强卡泊芬净的抗念珠菌效果，为解决卡泊芬净耐药问题提供了新的方法[12]。本研究中，我们通过棋盘式液基稀释法研究发现，硬脂酸单甘油酯与卡泊芬净合用具有较强的协同抗真菌效果。在不同的菌丝诱导培养基中，硬脂酸单甘油酯与卡泊芬净合用具有协同抑制菌丝形成的作用，该研究为硬脂酸单甘油酯在抗真菌中的应用提供了新的思路，但关于硬脂酸单甘油酯与卡泊芬净合用的协同抗菌机制尚不明确。

Rogers等研究临床常用的唑类、多烯类、棘白菌素类和嘧啶类的药物作用于白念珠菌的转录组时发现，除了嘧啶类药物外，其余几类药物作用于白念珠菌后，脂质代谢相关基因均会发生改变，这说明脂质代谢在白念珠菌抵御药物杀伤过程中十分重要。卡泊芬净作用于白念珠菌之后，脂肪酸脱氢酶Ole1p、肌醇-1-磷酸合成酶Ino1p、脂肪酸合成酶Fas1p、脂肪酸延长酶Fen12p等基因表达均发生改变[13]。Jin等通过蛋白组学考察卡泊芬净对白念珠菌的被膜的抑制作用时，也发现卡泊芬净作用后脂肪酸合成酶Fas1p表达增加[14]。因此我们推测，硬脂酸单甘油酯加入培养基后，可以改变白念珠菌的脂质代谢途径，进而使其对卡泊芬净更加敏感，但具体的信号通路和作用机制需要进一步的通过转录组学、代谢组学等方式深入研究。此外，动物体内的脂肪中含有大量的硬脂酸，这些硬脂酸是否影响了卡泊芬净的体内抗真菌效果也值得进一步考察[15]。本研究虽然尚未阐明硬脂酸单甘油酯协同卡泊芬净抗念珠菌的具体机制，但为卡泊芬净的增敏剂研究和药物剂型改造中辅料的选择提供了新的思路。