辣椒抗番茄环纹斑点病毒的种质资源筛选

赵立华 朱阳阳，2 邱润霜，2 李博文，2 李 靖 董家红，3*

（1 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南省农业生物技术重点实验室，农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室，云南昆明 650233；2 西南林业大学生命科学学院，云南昆明 650224；3 云南中医药大学中药学院，云南昆明 650500）

番茄环纹斑点病毒（tomato zonate spot virus，TZSV）属于布尼亚病毒目（Bunyavirales）番茄斑萎病毒科（Tospoviridae）正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus），于2008年在云南红河首次发现并报道（Dong et al.，2008）。TZSV 具有与该属的番茄斑萎病毒（tomato wilt spotted virus，TSWV）一样典型的病毒粒体特征：球形，直径80～120 nm，具有双层脂膜组成的包膜（郑宽瑜 等，2015）。TZSV 寄主广泛，自然状态下可侵染茄科、菊科、豆科、鸢尾科等34 个科共166 种植物，既可通过汁液摩擦接触传播，也可通过烟蓟马和西花蓟马等昆虫介体以持久增殖的方式进行传播（Dong et al.，2010；赵绕芬和王小兵，2012；Liu et al.，2014）。植物感染TZSV 后，感病植株叶片通常出现黄色同心环纹坏死斑，果实出现明显同心环斑，发病严重时伴随植株矮化、顶芽萎蔫下垂，植株无果，严重时可造成病害发生地绝收（尹跃艳 等，2008；Dong et al.，2013）。目前，TZSV 在云南红河、文山、石林等地对辣椒、番茄、烟草、花卉等作物造成严重经济损失。

病毒病是辣椒栽培生产上的主要病害，危害严重的主要病毒有番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、马铃薯Y病毒（potato virusY，PVY）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、番茄褪绿病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）、番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）等近50 种病毒（郭思瑶 等，2015）。TZSV 的暴发严重影响了辣椒的生产，不仅使果实品质变差，商品价值降低，同时也造成严重的经济损失。农业防治和物理防治方法不能长期有效控制TZSV 的蔓延，而施用化学药剂易对生态环境造成严重威胁（Turina et al.，2016）。朱阳阳等（2019）在大田试验中发现，不同辣椒品种田间对辣椒病毒病表现出明显抗性差异，选育抗病品种是控制病毒病最有效的措施之一，在辣椒生产基地和病毒病常发地区，应种植抗病毒或耐病毒的优良品种。我国辣椒病毒病的研究基础薄弱，目前鲜见抗TZSV 的种质资源报道，且栽培辣椒品种繁多，导致发病地区盲目选择辣椒品种。本试验对我国40个辣椒栽培品种进行TZSV 抗性评价，以期为发病地区选择辣椒品种提供指导，有效降低病害带来的经济损失。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试辣椒品种信息详见表1。TZSV 毒源分离株采自云南石林烟草，由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所作物病毒研究与应用团队保存和提供。TZSV 单克隆抗体由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所作物病毒研究与应用团队制备提供。

表1 参试辣椒品种及信息

1.2 试验方法

1.2.1 病毒接种 将保存于-80 ℃冰箱的TZSV感染病样接种于5～6 叶期的本生烟（Nicotiana benthamiana）上，5～7 d 后接种叶的上位叶（系统叶）出现黄色同心环纹、环形带状白绿相间褪绿斑点时，分别采集其系统叶，加入接种缓冲液进行研磨，研磨成汁液后待用。使用感病植物汁液进行接种，接种浓度为100 mg·mL-1。

试验于2017年5—12 月在云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所人工气候室内进行。辣椒幼苗栽种于腐质土∶蛭石∶珍珠岩=2V∶1V∶1V的土壤中，白天温度设置为26 ℃，14 h；夜间温度为24 ℃，10 h。待幼苗生长至4～5 叶期，摩擦接种TZSV，10 min 后用ddH2O 冲洗，每个辣椒品种接种10 株，3 次重复。

1.2.2 ID-ELISA 检测 以健康的辣椒叶片作为阴性对照，感病辣椒叶片作为阳性对照，取症状明显的辣椒叶片约0.2 g 研磨成汁液，加入500μL PBS 缓冲液混匀（1m∶30V），取100μL 样品于酶标板上，每个待测样品2 次重复，37 ℃孵育2 h；用PBST 洗板6 次后，加入200μL 2%牛血清蛋白的PBS 封闭液，37 ℃封闭2 h 或4 ℃过夜封闭，PBST 洗板6 次，向酶标板中加入100μL 效价1∶8 000 的TZSV 单克隆抗体，37 ℃放置2 h；将酶标板拍干，加入100μL 效价1∶8 000 的羊抗鼠抗体，37 ℃放置2 h；PBST 洗板6 次，将酶标板拍 干，加入1 mg·mL-1100μL 显色液，37 ℃避光放置30 min，在酶标仪上读数，吸收波长为405 nm。

1.2.3 辣椒发病情况调查 接种TZSV 5～6 d 后，植株开始出现发病症状，每隔2 d 调查1 次发病症状及病级，共调查3 次（感病植株全部发病结束调查），计算病情指数。根据发病症状和病情指数进行分级（表2）：免疫（I）（DI=0），高抗（HR）（0 ＜DI ≤10），抗病（R）（10 ＜DI ≤30），中抗（MR）（30 ＜DI ≤40），感病（S）（40 ＜DI ≤50），高感（HS）（DI ＞50）（朱阳阳 等，2019）。调查完毕采集辣椒系统叶进行ID-ELISA 检测。

表2 辣椒TZSV 病害分级标准

2 结果与分析

从图1 和表3 可以看出，丰达108、海南黄灯笼椒仅在接种叶产生褪绿、坏死枯斑，植株正常生长、开花结果（图1-A、1-B）；丰达108 发病率虽为100.0%，但其单株发病程度较轻，ID-ELISA检测值偏低，病情指数30.00，为抗病（R）；海南黄灯笼椒的发病率为50.0%，病情指数27.78，为抗病（R）。大果灯笼椒接种叶出现不同程度的白绿相间褪绿斑点、坏死枯斑，系统叶少部分出现褪绿斑点，但植株没有死亡，新发的系统叶有隐症现象，部分隐症叶片用ELISA 检测不到病毒，可以正常开花结果，部分花瓣脱落（图1-C），发病率为88.9%，病情指数49.38，为感病（S）。PI-152225、圣鼎1 号、泰国灯笼朝天椒、万豪A4F1、赤选牛角王等品种均达到高感（HS）级别；接种TZSV 后，植株出现不同程度坏死、矮化，甚至绝收（图1-D），ID-ELISA 检测结果与病害调查结果大致相符。综上所述，C.annuum中的丰达108、海南黄灯笼椒、大果灯笼椒具有抗TZSV 的潜力，可应用于TZSV 发病地区栽培。

表3 ELISA 检测法对辣椒栽培品种TZSV 抗性鉴定结果

3 讨论与结论

辣椒病毒病的传毒介体蓟马分布广、传毒率高，加之番茄斑萎病毒属病毒具有很高的重配和变异率，给病毒病防治带来较大难度（Cebollacornejo et al.，2003）。本试验采用摩擦接种的方法对40 个辣椒栽培品种进行TZSV 抗性鉴定，筛选出抗TZSV 的辣椒品种丰达108 和海南黄灯笼椒，其余品种均表现为感病和高感，说明市场上目前抗TZSV 的品种很少。目前国内外鲜见有关辣椒栽培品种的TZSV 抗性评价，因此，关于抗TZSV 育种材料的鉴定以及TZSV 的抗性育种研究尤为重要。

相比于甜椒、线椒、朝天椒等品种，小米辣及灯笼椒中可能具有抗TZSV 的辣椒材料。本试验筛选到的丰达108、海南黄灯笼椒可适当在TZSV 发病地区推广种植；大果灯笼椒虽为TZSV 感病品种，但在发病后仍会有一定的产量，可在发病相对较轻的地区种植，辅以相应的综合管理措施，从而避免严重的经济损失；而本试验中绝大部分高感品种，只能在无病区种植。今后应充分利用这些优良种质，挖掘其中的抗病基因，选育抗病新品种。本试验筛选的丰达108、海南黄灯笼椒等品种品质相对优良，可作为辣椒TZSV 抗病性改良等基础研究的亲本材料。本试验结果可为辣椒抗病育种提供可靠的抗病性信息，同时也可为其他植物的TZSV 抗性鉴定方法提供参考借鉴。