妊娠早期饲粮中添加N-氨甲酰谷氨酸对母羊早期胚胎存活及相关血液指标的影响

蔡元，罗玉柱，臧荣鑫，李春阳，扎西英派

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030；2.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州730070）

胚胎产前损失是哺乳动物繁殖过程中遇到的一个主要问题，绵羊（Ovisaries）和大多数哺乳动物的胚胎死亡损失在20%～40%，其中2/3发生在妊娠的附植期［1］，这严重限制了哺乳动物繁殖性能的发挥。胚胎着床失败是造成这些早期妊娠损失的主要原因，因此，减少早期胚胎着床失败是提高哺乳动物生殖效率的重要方法。虽然已有大量研究表明营养在胎儿发育和后续妊娠中发挥重要作用，但有关特定营养素对胚胎着床、胚胎存活和胚胎发育的影响的研究有限［2］。研究表明，精氨酸是体内合成一氧化氮（nitric oxide，NO）、多胺、蛋白质等物质的前体，精氨酸的代谢物NO对胚胎着床、胚胎发育和滋养层侵入、胎盘血管生成具有积极的调控作用［3-7］。但是精氨酸成本高，且饲粮中添加的精氨酸能够被反刍动物瘤胃微生物降解，因此，在生产中难以推广使用。N-氨甲酰谷氨酸（N-carbamylglutamate，NCG）是内源性精氨酸合成的激活剂［2］，能够促进精氨酸内源合成［8］。妊娠饲粮中添加NCG能促进大鼠早期胚胎着床和改善产仔性能［7］，在妊娠早期的母猪饲粮中添加NCG能够降低胚胎死亡率［9］、显著增加每窝产活仔数［2］，妊娠饲粮中添加NCG对改善胎盘血管功能、促进胎儿营养供应具有重要作用［10］，饲粮中添加NCG可促进鸡卵巢血管生成，促进卵泡发育［11］，限饲母羊日粮中补充NCG能够促进母羊胎盘的生长发育［12-13］，还可促进营养不良母羊的胎儿生长［14-15］。但目前还未见母羊妊娠早期饲喂NCG效果的相关报道。为此，本研究拟在母羊妊娠早期饲粮中添加NCG，研究其对胚胎存活、胎儿数量等指标的影响，以及对血浆游离氨基酸、总一氧化氮合酶（total nitric oxide synthase，TNOS）、内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthetase，eNOS）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、NO、雌二醇、孕酮的影响，初步探讨NCG对妊娠早期母羊繁殖性能的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

NCG（C6H10N2O5）≥97.0%，水分≤1.0%，总砷（以As计）≤0.5 mg·kg-1，铅（Pb）≤0.5 mg·kg-1，生产批号为T 190228031，为白色粉末，有微酸味，由国家饲料工程技术研究中心提供。

1.2 实验动物与试验设计

本试验所用母羊为纯种初产湖羊，35 kg时开始挑选生长状况良好，有过发情记录的母羊，最终选择50只发情正常、健康状况良好的母羊进行试验。将50只母羊随机分为2组：对照组和试验组，每组25只羊，每只母羊为1个重复，基础饲粮参照NRC（2004）体重40 kg的母绵羊妊娠前期的营养需要量配制。对照组饲喂基础饲粮（表1），试验组饲喂添加0.11%NCG的基础饲粮。母羊采用同期发情人工授精方式配种，配种当天计为妊娠第0天，从第一次人工授精开始给母羊分别饲喂各组试验饲粮，饲喂期38 d。

表1 饲粮组成和营养水平（干物质基础）Table 1 Composition and nutrient levels of diets（dry matter basis）

1.3 饲养管理及样品采集

试验于2019年8-10月在兰州七里河万山种植养殖专业合作社进行。母羊妊娠期平均饲喂量为2.7 kg（常规含水量），每天08：30和16：00饲喂两次。按照规章制度对羊场定期进行消毒和清洁，保持良好的通风。在14 d时开始用公羊试情，35 d时用B超测孕。每组选择8只体况相近的怀孕母羊，在妊娠第19、38天上午空腹颈静脉采血10 mL，置于有肝素钠的离心管内，静置30 min后，在4℃下以3000 r·min-1离心10 min后分离血浆样品，将血浆分装于1 mL的离心管中，保存于-80℃的超低温冰箱，用于测定血浆氨基酸、eNOS、iNOS、TNOS、NO；38 d采血后，各选取7只怀孕母羊将其屠宰，然后立即剖腹获取子宫称重后将其置于冰上，统计黄体数量，剪开子宫体，收集胎水、胎羊，记录胎水体积，记录胎羊数量和重量，测定胎羊的体长和体高，统计胎盘数、胎盘的长径和短径。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 母羊繁殖性能 记录黄体数量、子宫重、总胎儿数、活胎儿数、活胎儿总重、胎水体积，统计直径大于0.5 cm的胎盘的数量，测定最大的5个胎盘的长径和短径，测定胎儿的体长、体高和胎儿形成指数，本试验中的胎儿形成指数为38 d的胎儿数除以黄体数的大小，取值范围在0～1，在母羊健康状况、精液质量、输精条件一定的情况下，其主要影响因素为子宫内环境，其值越大，表示发情母羊排出的卵子受精、形成胚胎、发育成胎儿的能力越强，胚胎和胎儿的存活率越高。

1.4.2 血浆氨基酸浓度 采用德国赛卡姆Sykam（S-433D）（德国赛卡姆公司）氨基酸自动分析仪测定。

1.4.3 血浆TNOS、iNOS、eNOS、NO、雌二醇和孕酮浓度的测定 用南京建成生物工程研究所的试剂盒，按相应的试剂盒说明测定血浆TNOS（A 014-2-2）、iNOS（A 014-1-2）、eNOS（H 195，48 T）、NO（A 012-2-1）、雌二醇（H 102，48T）和孕酮（H 089，48T）的浓度。

1.5 数据处理

采用SPSS 23.0统计软件进行t检验，数据结果以平均值±标准误表示，统计显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 妊娠早期饲粮中添加NCG对母羊繁殖性能的影响

对照组和NCG组屠宰的7只母羊均怀孕。与对照组相比（表2），在妊娠第38天时，NCG组每只母羊总胎儿数增加了79.72%（P＜0.05），活胎儿数增加了79.72%（P＜0.05），胎水体积增加了72.89%，胎儿形成指数增加了0.26（P＜0.05）。然而黄体数、子宫重有增加但差异不显著（P＞0.05），直径大于0.5 cm的胎盘数减少了2.96个（P＞0.05），直径最大的5个胎盘的平均面积减少0.07 cm（2P＞0.05），NCG组的受胎率提高了5.20%（P＞0.05），饲粮添加NCG对母羊增重也没有显著影响（P＞0.05）。说明母羊妊娠早期饲粮中添加NCG后能够显著提高妊娠第38天的总胎儿数和活胎儿数，显著增加胎水体积，显著提高胎儿形成指数，能够改善湖羊的繁殖性能。图1为对照组妊娠第38天32号绵羊子宫的照片，图2为NCG组妊娠第38天19号绵羊子宫的照片，由图可见19号绵羊有3个黄体。图3为对照组妊娠第38天32号绵羊卵巢和胎儿的照片，32号绵羊有2个黄体和1个胎儿。图4为NCG组妊娠第38天19号绵羊胎儿的照片，19号绵羊有3个胎儿。

图1 对照组绵羊子宫Fig.1 Control group sheep’s uterine

图2 NCG组绵羊子宫Fig.2 NCG group sheep’s uterine

图3 对照组母羊卵巢和胎儿Fig.3 Contr ol gr oup sheep’s ovar y and fetus

图4 NCG组胎儿Fig.4 NCG gr oup fetuses

表2 妊娠0～38 d添加NCG对母羊妊娠第38天繁殖性能的影响Table 2 Reproductive performance on the 38th day of gestation of ewes fed a basal diet that was or was not supplemented with 0.11%NCG from days 0 to 38 of gestation

2.2 妊娠早期饲粮中添加NCG对胎儿发育的影响

与对照组相比（表3），在妊娠第38天时，NCG组活胎儿总重提高了71.13%（P＜0.05），活胎儿平均重降低4.70%（P＞0.05），胎儿体长减少0.16 cm，胎儿体高增加0.06 cm。说明妊娠早期饲粮中添加NCG后在增加胎儿数量的同时，并没有影响胎儿的正常发育。

表3 妊娠0～38 d添加NCG对第38天胎儿发育的影响Table 3 Effects of NCG supplementation fr om 0 to 38 days of gestation on fetal development on the 38th day

2.3 妊娠早期饲粮中添加NCG对母羊血浆游离氨基酸浓度的影响

NCG组19 d的谷氨酸极显著低于对照组（P＜0.01），甘氨酸、蛋氨酸、赖氨酸和精氨酸显著高于对照组（P＜0.05），瓜氨酸和脯氨酸极显著高于对照组（P＜0.01），鸟氨酸升高但差异不显著（P＞0.05），天冬氨酸降低但差异不显著（P＞0.05）；NCG组38 d的精氨酸和脯氨酸显著高于对照组（P＜0.05），天冬氨酸、谷氨酸和鸟氨酸低于对照组，但差异不显著（P＞0.05）；NCG组19和38 d其他氨基酸与对照组差异不显著（P＞0.05）。说明母羊妊娠早期饲粮中添加NCG后能够影响母羊血浆中部分游离氨基酸的浓度（表4）。

表4 妊娠0～38 d饲粮添加0.11%NCG对母羊血浆游离氨基酸含量的影响Table 4 Effect of NCG supplementation between days 0-38 of gestation on concentration of free amino acids in the plasma of ewes on days 19 and 38 of gestation（μmol·L-1）

2.4 妊娠早期饲粮中添加NCG对母羊血浆NO、TNOS、eNOS和iNOS浓度的影响

妊娠第19和38天NCG组的NO浓度显著高于对照组（P＜0.05）；妊娠第19和38天NCG组和对照组的TNOS浓度差异不显著（P＞0.05）；妊娠19 d NCG组的iNOS和eNOS浓度显著高于对照组（P＜0.05），妊娠38 d NCG组的iNOS和eNOS浓度极显著高于对照组（P＜0.01）。说明妊娠早期饲粮中添加NCG后能够显著提高血浆中NO、eNOS和iNOS的浓度（表5）。

表5 妊娠0～38 d添加0.11%NCG对母羊血浆NO、TNOS、eNOS和iNOS浓度的影响Table 5 Effects of NCG supplementation between days 0 and 38 of gestation on concentrations of NO，TNOS，eNOS and iNOS in the plasma of ewes on days 19 and 38

2.5 血浆激素含量

与对照组相比，NCG组妊娠19 d母羊血浆中的孕酮浓度比对照组高0.89 ng·mL-1（P＜0.01），NCG组38 d母羊血浆中的孕酮以及妊娠19和38 d的母羊血浆中的雌二醇均比对照组高，但差异不显著（P＞0.05）。说明妊娠早期饲粮中添加NCG后能够增加妊娠第19天血浆孕酮的浓度（表6）。

表6 妊娠0～38 d添加0.11%NCG对母羊血浆雌二醇和孕酮浓度的影响Table 6 Effects of NCG supplementation between days 0-38 of gestation on concentr ations of estradiol and progester one in the plasma of ewes on days 19 and 38

3 讨论

本研究结果表明，在妊娠早期的饲粮中添加0.11%NCG能够显著提高湖羊妊娠第38天的总胎儿数和活胎儿数，显著提高胎儿形成指数，显著增加活胎儿总重、胎水体积，能够显著增加精氨酸、脯氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、赖氨酸等部分血浆游离氨基酸的浓度。本试验中，NCG组的胎儿形成指数（0.86）比对照组的胎儿形成指数（0.60）高0.26（P＜0.05），说明NCG组的母羊人工授精后卵子受精、形成胚胎并发育成胎儿的能力比对照组强，添加NCG后提高了胚胎和胎儿的存活率，使NCG组胎儿的数量增加1只。母体营养是子宫内环境最主要的影响因素，给母体提供适宜的营养，有利于胚胎的生长发育［16］，同时对胚胎、胎儿的存活和生长发育也至关重要［17-20］。NCG是精氨酸体内合成途径中关键酶CPS-1的有效激活剂，在体内能够促进精氨酸合成［8］，使NCG组的精氨酸显著高于对照组。精氨酸对动物机体有多种有益作用，能促进血管生成，改善氮代谢，促进泌乳和生长，增强动物繁殖和免疫能力［21］，对已建立的绵羊滋养外胚层细胞系的增殖、迁移和蛋白质合成具有促进作用［22-23］，血清中的精氨酸、脯氨酸浓度的增加可以为胚胎早期发育和植入提供足够的营养，从而改善早期胚胎发育和着床［7］。在妊娠14～25 d给母猪添加0.4%和0.8%精氨酸分别使胎盘重量增加21%和34%（P＜0.01），每窝活胎数增加2个（P＜0.05），胚胎死亡率降低14%和15%（P＜0.01），使羊水总量极显著增加（P＜0.01），提高了胚胎和胎儿的存活［24］；给多胎母羊注射精氨酸盐能够减少胚胎损失，增加羔羊的出生体重，提高胎羔的成活率［25-26］；Cai等［2］在妊娠早期母猪饲粮中添加NCG后显著增加了每窝产活仔数（P＜0.05）；Zhu等［9］直接在妊娠0～28 d的母猪饲粮中添加0.05%NCG，NCG组妊娠第28天总胎儿数增加了1.32头（P＜0.05），活胎儿数增加了1.29头，胚胎死亡率降低11.8%（P＜0.05），胎盘总重和羊水总体积分别增加13%和18%（P＜0.05），活胎儿窝重比对照组高18%（P＜0.05），母猪妊娠第14和28天的血浆精氨酸和脯氨酸浓度显著增加（P＜0.05），本试验研究结果与以上报道的结果相一致。本试验中在饲粮中添加NCG后，可能激活了CPS-1，促进了精氨酸的内源合成，使体内精氨酸的浓度升高，在精氨酸的作用下提高了胚胎和胎儿的存活率，从而提高了妊娠第38天的总胎儿数和活胎儿数。添加NCG后，还提高了妊娠19 d NCG组甘氨酸、蛋氨酸、赖氨酸等部分血浆游离氨基酸的浓度，说明NCG还会影响NCG组其他氨基酸的代谢，具体原因有待进一步研究。

本研究发现，饲粮添加NCG能显著提高母羊血浆中eNOS的含量和iNOS的活力，NCG组NO的浓度也显著高于对照组。妊娠早期日粮中添加NCG会显著增加母猪子宫内膜中eNOS蛋白和mRNA的表达量［9］，经产母猪整个妊娠期饲粮中添加NCG能有效提高妊娠母猪血浆中iNOS的浓度［27］，妊娠母猪饲粮中添加NCG提高了母猪血浆NO含量［9，27-28］，本试验和这些结果类似。NO是由子宫内皮细胞产生的一种重要的舒张因子，能够在胎盘和胎儿间的血流调控中发挥重要作用，因此，会在母体给胎儿提供养分和氧气的过程中发挥重要的调控作用［29］，NO还通过重构细胞外基质调节胚胎着床［30］，在胎盘血管发育中起重要作用［31］，NO可诱导来自不同血管床的胎儿内皮细胞增殖［32-33］，并调节中心血管口径［34］。研究结果已经表明，NO是胎盘血管生成、胎盘发育、胚胎发育和胎儿生长的重要调控因子［32-37］。动物体内的NO是由精氨酸在一氧化氮合成酶（NOS）参与下生成［38］，因此精氨酸浓度的高低是影响NO合成的重要因素，同时精氨酸的浓度也是影响血管平滑肌产生iNOS的关键因素［27］，本试验中添加NCG组精氨酸浓度的显著升高有助于NO的生成和NOS活力的提高。因此，精氨酸在一氧化氮合成酶的作用下提高了体循环中NO的含量，促进了胎盘血管生成和发育，增加了胎盘的血流量［27，31，39］，在促进胎盘发育的同时为胚胎着床、妊娠期胚胎发育、胎儿的存活与生长提供了最适的子宫环境，使胚胎和胎儿存活率提高，并促进了胎儿的发育，因此本研究中妊娠第38天的总胎儿数、活胎儿数和活胎儿总重增加。这可能是在妊娠早期饲粮中添加NCG后能够改善绵羊繁殖性能的作用机理。

雌激素和孕激素是调控妊娠的主要激素，它们在卵细胞的转运、内皮细胞的增殖和分化、子宫内皮细胞的蜕膜化以及胚胎的着床过程中都扮演着重要的调控作用，从而对于哺乳动物妊娠的建立和维持起着至关重要的作用。本试验中NCG组妊娠19和38 d的孕酮均比对照组高，尤其是NCG组在妊娠19 d的孕酮显著增加，因精氨酸也是一种激素促分泌素［40］，能够促进激素的分泌，孕酮和雌激素等含量的变化与母羊胚胎着床和妊娠维持关系非常密切。本试验中NCG组母羊的黄体数量均比对照组多，分泌的孕酮也多，使NCG组19 d时血浆中孕酮的含量显著升高。妊娠初期，孕激素促进子宫内膜增生，使腺体发育、功能增强，从而有利于胚胎附植［41］。

4 结论

妊娠早期饲粮中添加NCG，提高了胚胎和胎儿的存活，增加了妊娠母羊第38天总胎儿的数量和活胎儿数量，改善了母羊的繁殖性能，其作用机制可能是NCG促进了母羊内源性精氨酸的合成，提高了母羊血浆精氨酸、NO和孕酮含量，改善了子宫内环境和营养供给，使之有利于胚胎着床和妊娠维持。