基于网络药理学探究转腰汤治疗退行性腰椎管狭窄症的作用机制

李路广 朱立国 高景华，2 高春雨 王宝剑 魏 戌 尹逊路 李 辉

1.中国中医科学院望京医院脊柱二科，北京 100102；2.中医正骨技术北京市重点实验室，北京 100102

退行性腰椎管狭窄症(DLSS)是指由于黄韧带增生退变等因素造成椎管、椎间孔或侧隐窝狭窄，压迫神经根或硬膜囊，从而引起以腰腿痛、间歇性跛行为主要临床症状的综合征[1]。DLSS 好发于中老年人群，现已成为严重影响中老年人生活质量的公共健康问题[2]。DLSS 治疗主要分为手术治疗和非手术治疗，然而DLSS 患者往往年龄大，全身情况差，手术耐受力低，因此手术通常不作为首选治疗方案[3]。明确DLSS发病机制，采用针对性药物治疗改善患者的临床症状和延缓腰椎管退变的进程，减少患者对手术的需求已成为当前治疗DLSS 的生物学研究热点。转腰汤出自清代陈士铎《辨证录·腰痛门》，该方是治疗腰痛病的经典古方，以温肾健脾为本，祛瘀化痰为标，治疗DLSS效果显著[4]，但其作用机制尚不明确。因此，本研究使用网络药理学分析转腰汤中各成分与DLSS 之间的相互作用关系，并挖掘网络中的关键节点，系统阐述转腰汤的物质基础及分子机制，为后续基础研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 转腰汤活性成分及靶点筛选

使用TCMSP 和BATMAN 中医药系统药理学平台[5-6]获取转腰汤所含化学成分，以口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18 的药物动力学属性值对化合物进行筛选，另外根据文献[7-9]补充未预测到的活性成分。使用Uniprot 蛋白质数据库(https：//www.uniprot.org)将活性成分作用的蛋白质靶点统一转换为基因名。

1.2 转腰汤“活性成分-靶点”网络构建

采用Cytoscape 3.7.2 构建转腰汤“活性成分-靶点”网络，其中节点(node)表示活性成分或靶点，边(edge)表示两者之间的关系。通过Cytoscape 3.7.2 内置“network analyzer”功能分析网络特征参数，以研究转腰汤中重要活性成分和靶点之间的关系。

1.3 DLSS 靶点筛选

以“Degenerative Lumbar Stenosis”“Degenerative Lumbar Spinal Stenosis”为检索词，通过DisGeNET(https：//www.disgenet.org)、GeneCards(https：//www.genecards.org)和OMIM(http：//www.omim.org)3 个疾病数据库检索DLSS 的潜在致病靶点。

1.4 转腰汤治疗DLSS 共同靶点筛选

通过Bioinformatics(http：//www.bioinformatics.com.cn/)绘制转腰汤活性成分靶点和DLSS 致病靶点的韦恩图。

1.5 转腰汤成分-DLSS 致病靶点蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建

将转腰汤与DLSS 的交集靶点导入String 数据库(https：//string-db.org)，物种设置为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设置为“highest confidence：0.9”，并隐藏游离点，其余均为默认设置，获得转腰汤治疗DLSS 的PPI 网络。将“string_interactions.tsv”文件导入Cytoscape 3.7.2 中，运用“network analyzer”功能进行拓扑属性分析。

1.6 转腰汤成分-DLSS 靶点的GO 富集分析和KEGG分析

借助Metascape(http：//metascape.org)对转腰汤治疗DLSS 的核心靶点进行GO 和KEGG 分析。GO 诠释关键靶点治疗DLSS 的生物进程，包括生物过程(BP)、细胞组成(CC)和分子功能(MF)3 个部分。KEGG 分析诠释关键靶点治疗DLSS 的主要信号通路。筛选具有显著差异的GO 和KEGG，借助ImageGP 平台对结果进行可视化分析。

2 结果

2.1 转腰汤活性成分筛选

筛选出转腰汤有效活性成分108 个，其中白术7 个、杜仲28 个、巴戟天20 个、防己2 个、肉桂2 个、苍术9 个、羌活17 个、桃仁23 个。另外文献补充有效活性成分8 个(白术：苍术酮、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ，防己：汉防己甲素、汉防己乙素，肉桂：肉桂醛、肉桂酸)。去掉其中无蛋白靶点的成分和重复成分，共筛出有效活性成分86 个。见表1。

表1 转腰汤主要活性成分

2.2 转腰汤“活性成分-靶点”网络构建与分析

通过Cytoscape 3.7.2 对转腰汤活性成分和作用靶点的关系网络进行分析，获得271 个节点(185 个靶点和86 个活性成分)和908 条边，图中节点的大小代表相应的Degree 值，节点越大则Degree 值越大，说明其生物功能越多，重要性越高，见图1。图中Degree 值最大的前3 个化合物包括杜仲中的槲皮素(quercetin)和山奈酚(kaempferol)，巴戟天、杜仲、防己、桃仁和羌活的共有成分β-谷甾醇(beta-sitosterol)；Degree 值最大的前3 个基因PTGS2、PTGS1、NCOA2 是杜仲、巴戟天、防己、肉桂、羌活、桃仁的共同靶点，PTGS2 还是白术和苍术的共同靶点，PTGS1 是苍术的靶点，NCOA2是白术的靶点。

图1 转腰汤“活性成分-靶点”网络图

2.3 DLSS 靶点筛选

从DisGeNET、GeneCards 和OMIM 中分别检索到1 个、1068 个和114 个与DLSS 相关的致病靶点，删除重复值，共纳入1168 个与DLSS 相关的靶点。

2.4 PPI 网络构建与分析

韦恩图显示，转腰汤和DLSS 有84 个共同作用靶点，见图2。把84 个交集靶点提交至String，剔除11 个游离节点，通过Cytoscape 3.7.2 对“string_interactions.tsv”文件进行分析，图中节点颜色深浅、大小和边颜色深浅、粗细均与Degree 值相关，Degree 值大小与生物功能和生物重要性呈正相关。其中JUN、TNF、AKT1、MAPK1、白介素(IL)-6 等存在较多的交互关系，见图3。

图2 转腰汤成分-退行性腰椎管狭窄症靶点韦恩图

图3 转腰汤成分-退行性腰椎管狭窄症靶点PPI 网络

2.5 GO 富集分析和KEGG 分析

将转腰汤治疗DLSS 的靶点上传至Metascape 进行GO 富集分析和KEGG 分析。根据-Log10(Qvalue)值排序，选择具有显著性差异的GO 生物进程和KEGG通路绘制气泡图，见图4(封三)。GO 共有1987 个富集结果，其中BP 有1805 个，主要涉及细胞增殖负调控、活性氧代谢过程、细胞成分运动的正调节等，见图4A(封三)；CC 有57 个，主要涉及膜筏、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子复合物、囊腔等，见图4B(封三)；MF 有125 个，主要涉及细胞因子受体结合、核受体活性、蛋白质结构域特异性结合等，见图4C(封三)；KEGG通路142 条，主要有IL-17 信号通路、低氧诱导因子(HIF)-1 信号通路、NF-κB 信号通路等，见图4D(封三)。

图4 转腰汤主要成分潜在靶点的富集分析(见内文第14 页)

3 讨论

DLSS 属于中医学“痹症”“腰痛病”的范畴，基于“阳化气，阴成形”理论，现代医家认为DLSS 多因久病耗伤脾肾阳气，阳虚则推动、温煦等“阳化气”功能不足；阳消阴长，久则水湿、痰瘀之邪积聚，则见黄韧带肥厚、关节突关节增生内聚等“阴成形”功能失调；故以温肾健脾、祛瘀化痰为治法[10]。黄韧带附着于椎管后壁和外侧壁，其增生退变导致椎管直径减小是DLSS 发病的重要原因[3]。近年来中药复方治疗组织纤维化疾病已展现出较为广阔的前景，在前期临床研究中转腰汤治疗黄韧带肥厚型DLSS 取得较好的效果[4，11]。采用现代科学手段挖掘经典古方的科学内涵，明确转腰汤抗纤维化作用的有效成分，通过延缓或抑制黄韧带纤维化进程将成为治疗DLSS 的重要手段。

活性成分筛选结果提示槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚是转腰汤的关键活性成分。Park 等[12]研究发现，黄韧带纤维化退变与韧带组织中成纤维细胞异常增殖和凋亡抑制密切相关。Ren 等[13]研究发现，槲皮素可通过联合抑制mTOR、β-catenin 信号转导途径抑制成纤维细胞活化。而β-谷甾醇具有抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用，在清除受损细胞和维持组织器官完整上发挥着关键作用[14]。炎症反应诱导组织纤维化是导致黄韧带肥厚的主要病理机制。研究表明山奈酚可通过MAPK、AKT 等通路途径抑制IL-1β、IL-6、IL-8 等炎症因子的表达[15-16]。

PPI 结果提示JUN、TNF、AKT1、MAPK1、IL-6 等靶点可能是转腰汤治疗DLSS 的关键作用点。Nakama等[17]研究发现，在退变的黄韧带组织中存在细胞低凋亡率的现象，而激活的c-JUN 可参与诱导细胞的凋亡[18]。肿瘤坏死因子(TNF)、IL-6 等炎症细胞因子刺激是造成黄韧带肥厚的主要病理诱因，且IL-6 对TNF-α 的炎症作用具有放大效应[19]。AKT1 作为PI3K/AKT 信号通路中的关键调控因子参与多种组织器官的纤维化进程，因此推测转腰汤可能通过调控AKT1抑制DLSS 患者黄韧带的纤维化[20]。卢昌怀等[21]研究发现，p38 MAPK 在肥厚的黄韧带组织中高度表达，而MAPK1 是MAPK 通路中的重要蛋白激酶与调控因子，因此通过调控MAPK 信号通路将为黄韧带肥厚引起的DLSS 提供新的治疗思路。

转腰汤治疗DLSS 的GO 功能富集分析提示，GO的关键基因靶点主要涉及细胞增殖负调控、膜筏、细胞因子受体结合等生物学过程。从KEGG 通路结果发现，转腰汤可通过IL-17 信号通路、HIF-1 信号通路、NF-κB 信号通路等转导途径调控DLSS 的退变进程。T 细胞分泌的炎症细胞因子IL-17 可以刺激上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞产生IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞刺激因子等多种细胞因子，从而介导炎症的产生[22]。Löhr 等[23]在人肥厚的黄韧带弹力基质区域内发现大量巨噬细胞和T 淋巴细胞的存在。另外，当IL-17 与受体结合后，可通过NF-κB、MAPK 等信号途径发挥生物学作用[24]。HIF-1 广泛存在于人体组织器官中。研究表明，HIF-1 信号通路可通过调控炎症反应、诱导上皮间质转化及调节细胞外基质沉积等发挥抗纤维化作用[25]。Nayak 等[26]研究发现，抑制PI3K、AKT 的活性可以降低下游HIF-1α 的表达，进而延缓小鼠肾纤维化进程。NF-κB 信号通路参与调节多种生理病理过程，当该通路被持续激活会导致细胞增殖和凋亡异常，另外TNF 作为NF-κB 通路上游的主要刺激信号，可参与NF-κB 信号转导途径的促进纤维化进程[27]。

本研究通过网络药理学阐释了转腰汤治疗DLSS的药理机制，揭示转腰汤可以通过多靶点、多途径治疗DLSS，同时也为下一步基础实验研究提供理论依据。