酶促水解斯替夫苷制甜茶苷及其反应路径解析

周卓愉，夏咏梅*

（1.江南大学 化学与材料工程学院，江苏 无锡214122；2.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡214122）

甜茶苷（Rubusoside，13-O-β-glucosyl-19-Oβ-D-glucosyl-steviol，Ru）是一种稀少的天然甜味剂，少量存在于我国特有珍稀植物甜茶中[1-2]，产量较低且受气候、产地等因素影响。目前尚无化学全合成甜茶苷的报道。由于斯替夫苷（Stevioside，13-O-β-sophorosyl-19-O-β-D-glucosyl-steviol，St）与甜茶苷的结构相似性（甜茶苷仅在C13位比斯替夫苷少一个β-1，2连接的葡萄糖基），已有许多关于酶法催化水解斯替夫苷制备甜茶苷的报道（表1）。然而，目前的研究尚有一些未决问题，例如甜茶苷的产率较低、副产物结构及反应路径不明等。

斯替夫苷具有3个以β-糖苷键链接的葡萄糖残基，酶催化反应下葡糖基单元的连续水解及重排可能产生：甜茶苷、甜菊双糖苷、甜菊醇单葡萄糖酯、甜菊单糖苷或甜菊醇[9]（图1）。目前对于甜菊糖苷的鉴定，通常仅采用HPLC以及LC-MS确定相对分子质量以及保留时间。然而，互为同分异构体的甜菊糖苷在HPLC中具有近似甚至相同的保留时间，仅上述表征手段无法明确副产物的结构。

酶对不同糖苷键的特异性水解决定了副产物中葡萄糖基的连接方式。例如相对分子质量为480的单葡萄糖基甜菊醇，其可能的结构为甜菊单糖苷（葡萄糖基接于C-13位）或甜菊醇单葡萄糖酯（葡萄糖基接于C-19位），其可能是斯替夫苷直接水解产生的一级水解产物亦可能是甜茶苷进一步水解产生的二级产物。明确产物结构及反应方式有助于进一步了解酶的催化反应机理。

本研究首次确定了β-葡萄糖苷酶水解斯替夫苷产生的副产物结构及其生成方式，明确解析出β-葡萄糖苷酶催化水解斯替夫苷的反应路径。

表1 已报道的斯替夫苷水解制甜茶苷研究Table 1 Reported studies on hydrolysis of stevioside to rubusoside

图1 斯替夫苷可能的水解产物Fig.1 Possible hydrolysis products of stevioside

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

来自Aspergillusniger的β-葡萄糖苷酶（ATCC®16404，39 000 U/g）：由江南大学吴敬教授提供；斯替夫苷（97%，HPLC）：由诸城市浩天药业有限公司提供；乙腈（HPLC）：购自Oceanpak（瑞典）；甲醇、乙酸、乙酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化铁、氯化铜、硝酸银、氯化镁、氯化钡、氯化钾：均购自国药集团化学试剂有限公司（上海）。

1.2 仪器与设备

液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪（Waters Acquity UPLC和Waters Maldi Synapt Q-TOF MS）：美国Waters公司产品；高效液相色谱仪2695（二极管阵列检测器996，Masslynx色谱工作站）：美国Waters公司产品；KQ 22000型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品；EL 204电子天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司产品；葡萄糖生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所产品；核磁共振仪（Bruker Avance III 600）：德国布鲁克公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 β-葡萄糖苷酶催化水解斯替夫苷 在50 mL锥形瓶中加入20 mL斯替夫苷溶液（质量浓度为100 g/L），在60℃下保温30 min。加入1%底物质量的β-葡萄糖苷酶，60℃水浴中振荡（150 r/min）反应24 h。定时取样，用等体积甲醇终止反应。用葡萄糖生物传感分析仪测定不同时间反应液中葡萄糖质量浓度，斯替夫苷转化率、甜茶苷产率计算如下：

式中：C0是反应液中St的初始质量浓度（g/L），Ct是t时刻反应液中St的质量浓度（g/L），CRu是反应液中Ru的质量浓度（g/L）；M WRu=642，M WSt=804，分别为Ru和St的摩尔质量。以斯替夫苷标准品的质量浓度-峰面积标准曲线计算出反应液中St与Ru的质量浓度。

1.3.2 水解产物的分离与结构表征 1.3.1中所得反应液各组分的相对分子质量通过液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪（Waters Acquity UPLC和Waters Maldi Synapt Q-TOF MS）进行鉴定。检测条件 为：BEH HILIC色 谱 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱温45℃；流动相组成：流动相A（80%乙腈+0.1%氨水，体积分数），流动相B（30%乙腈+0.1%氨水，体积分数）；梯度洗脱：0～10 min，流动相A体积分数为80%；10～20 min，流动相A体积分数从80%线性减至60%；20～26 min，流动相A体积分数为60%；26～27 min，流动相A体积分数从60%线性增至100%；27 min，流动相A体积分数为100%，流速为0.3 mL/min；进样量1μL，进样质量浓度1 mg/mL。质谱条件：碰撞电压6 V，锥孔电压20 V，离子化方式为电喷雾电离（ESI），离子源温度100℃，负离子检测模式，相对分子质量范围为200～2 000。

通过制备TLC纯化水解产物，得相对分子质量为480与1 128的化合物（用Waters Maldi Synapt Q-TOF MS鉴定）。洗脱剂为正丁醇∶乙酸乙酯＝4∶1（体积比）的水饱和溶液。纯化所得水解产物溶解于氘代甲醇，用Bruker Avance III 600核磁共振仪，分别在600和151 MHz下记录1H-NMR和13C-NMR谱。用液氦冷冻探针于25℃下测试。所有化学位移以氘代甲醇的1H（3.3）和13C（47.6）为基准。

1.3.3 斯替夫苷水解条件优化 采用单因素法考察温度、pH、金属离子、底物浓度、加酶量、反应时间及加酶方式对β-葡萄糖苷酶水解斯替夫苷的影响。

2 结果与分析

2.1 水解产物结构解析

如图2所示，在β-葡萄糖苷酶的催化下，斯替夫苷水解成相对分子质量分别为642与480的化合物，即二者分别比斯替夫苷少1个或2个葡萄糖基。用NMR分析纯化后的产物，二者的核磁1H和13C谱见图3、图4，水解主产物的质子化学位移汇总于表2。主水解产物（相对分子质量为642）的HMBC图谱（支撑材料图S1）有明显的葡萄糖H1与甜菊醇骨架13位、19位上C的耦合信号峰，可以确定两个葡萄糖基分别连接在C13与C19位上，排除甜菊双糖苷的可能，确定主水解产物是甜茶苷。副水解产物（相对分子质量为480）的化学位移通过对照文献报道值[10]，确定其结构为甜菊醇单葡萄糖酯。

2.2 水解反应条件优化

前期实验表明，β-葡萄糖苷酶具有高效特异性水解斯替夫苷制备甜茶苷的能力（数据未发表）；为便于工业化，进一步研究了该反应的最适条件，如图5所示。该酶的催化活性对温度较为敏感，在60℃，pH为5时具有最强催化活性（图5（a）、（b））；考虑到在纯水相中反应速度与pH为5时相近，且不会引入用于调节pH所需的化合物，后续试验均用纯水相作为反应介质。Fe3+、Ag+、Cu2+对反应有明显抑制效果（图5（c））；可能是这些金属离子与酶形成配位键，从而影响了酶的活性，因此在生产中应尽量避免这类金属离子的混入。底物浓度不会影响水解反应的速率，表明在此浓度范围内，水解反应不存在底物抑制作用（图5（d））。底物质量浓度为200mg/mL时，加酶量为300 U/g底物，反应24 h后St转化率为98.2%，Ru的产率为90.8%；当加酶量为800 U/g底物，反应12 h后St的转化率达98.8%，Ru的产率为9 0.4%。增大加酶量不会明显改变S t的转化率及R u的产率。水解反应是一个平衡反应，为了尽可能减少副产物的生成，可在S t转化率达4 0%左右时移去甜茶苷（图5（e）、（f））。受S t溶解度限制，难以在反应温度下配制高浓度的S t溶液用于工业生产，而产物R u作为一种增溶剂，不仅自身溶解度高，并且能有效提高S t在水中的溶解度，如图5（g）所示，采用流加S t的方式，最高可实现质量分数为5 5%的S t制备R u，有利于工业上R u大规模生产。

图3 主水解产物的1H-NMR谱和13C-NMR谱Fig.3 1H-NMR and 13C-NMR profiles of the main hydrolysis product

图4 副水解产物的1H-NMR谱和13C-NMR谱Fig.4 1H-NMR profile and 13C-NMR profile of the minor hydrolysis product

表2 水解主产物的化学位移Table 2 Chemical shifts of the main hydrolysis product

图5 黑曲霉β-葡萄糖苷酶催化水解斯替夫苷反应条件优化Fig.5 Single factor test on production of Ru from St with theβ-glucosidase from Aspergillus niger

2.3 水解途径确定

通过实时检测反应液中的游离葡萄糖含量，以及对甜茶苷的单独酶促水解实验，来进一步确定反应过程，特别是副产物甜菊醇单葡萄糖酯的生成方式。由图6（a）、（b）可知，β-葡萄糖苷酶不能催化甜茶苷的水解；由此可推断：原水解反应体系中的甜菊醇单葡萄糖酯是由St直接水解得到。图6（c）中St水解时溶液中游离葡萄糖含量与理论值的差值归因于副产物甜菊醇单葡萄糖酯的生成。

图6 St水解途径的确定Fig.6 Determination of St hydrolysis pathway

3 结语

关于水解斯替夫苷制备甜茶苷已有一系列报道，然而尚无对水解反应的具体副产物及反应过程的解析。本研究采用来自Aspergillus niger的β-葡萄糖苷酶高效特异性水解斯替夫苷。通过过程分析，确定主要的水解产物为甜茶苷，副产物为甜菊醇单葡萄糖酯。在加酶量为800 U/g底物时，仅12 h，斯替夫苷的转化率就可达98.8%，产率为90.1%。该水解反应无底物抑制作用，连续加酶有利于工业上甜茶苷的高通量生产。同时，明确了β-葡萄糖苷酶水解斯替夫苷的水解过程，有利于对该酶催化反应机理的进一步认识。