颐脑解郁方对血管性痴呆大鼠模型甲状腺轴功能的影响

寇娜 郝钰 赵瑞珍 赵子珺 唐启盛

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是指由缺血性卒中等原因所致的认知功能障碍综合征，是继阿尔茨海默病后第二大痴呆类型，约占所有痴呆类型的20%[1-2]。多项临床研究表明VD患者可能合并甲状腺激素水平的变化，且低甲状腺激素可进一步加速VD患者认知功能障碍[3-6]。VD患者多表现为思维迟滞、不寐、乏力、腰膝酸软、胸胁胀满、面色晦暗、舌淡或暗、苔白、脉沉细或沉弦，中医辨证多属肾虚肝郁证型。先前的研究表明颐脑解郁方能够改善肾虚肝郁型VD大鼠的认知功能，但是否与调节甲状腺激素水平相关少有报道[7]。本实验通过观察VD大鼠下丘脑—垂体—甲状腺轴(hypothalamus pituitary thyroid axis，HPT)相关因子的变化，探讨颐脑解郁方是否通过调节甲状腺激素水平来改善VD大鼠的认知功能障碍。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级雄性Wistar大鼠(6周龄，体质量200～220 g)由北京维通利华实验动物技术有限公司提供动物许可证：SCXK(京)2016-0006。大鼠适应性预养1周，自由摄食和饮水，动物房室温22～25℃，相对湿度55%～65%，光照周期昼夜各12小时。

1.2 动物模型建立及分组

大鼠VD模型参考Longa等[8]报道的线栓造模方法，手术过程中室内温度保持27～30℃，并采用数字量表评价大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)神经功能，选择术后24小时评分为7～12分中度损伤大鼠，不予干预4周后自然痴呆经跳台实验筛选后选出[9]。

实验将30只VD大鼠随机分为VD模型组、VD中药组，每组15只。15只假手术组大鼠除不结扎外，其余步骤完全与VD造模方法相同。正常组选取15只正常大鼠不予任何干预。其中VD中药组大鼠灌胃中药颐脑解郁方(大鼠灌胃剂量根据成人用量的7倍进行计算，配成419 mg/kg混悬液，每日剂量为10 mL/kg，灌胃量根据每周大鼠的体质量变化调整)。正常组、假手术组、VD模型组大鼠常规饲养，灌胃0.9%生理盐水，每日剂量10 mL/kg，连续4周。动物保健及使用经过北京中医药大学伦理委员会实验协议批准。

1.3 主要仪器和试剂

二甲苯购于天津市进丰化工有限公司；无水乙醇购于北京化工厂；促甲状腺素(thyroid-stimulating hormone，TSH)放免试剂盒、游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine，FT3)放免试剂盒、游离甲状腺素(free thyroxine，FT4)放免试剂盒由北京华英公司提供；戊巴比妥购于国药集团化学试剂北京有限公司。Morris水迷宫设备由北京中医药大学基础医学院提供；DTT-2跳台仪由中国科学研究院提供；生物组织包埋机(型号YD-6L)购于金华市益迪医疗设备有限公司；石蜡切片机(型号FINESSE 325)购于SHANDON公司；超纯水仪(型号D7411)购于美国Barnstead公司；光学显微镜(型号BN-2)购于日本Olympus公司。图片处理运用NIS-Elements B R Version2.34及AMT Image Capture Engine图片成像软件完成。

1.4 主要药品

颐脑解郁方(刺五加20 g、栀子10 g、五味子10 g、郁金10 g)购于北京中医药大学第三附属医院中药房，配方颗粒由北京康仁堂药业有限公司提供。灌胃剂量按照成人常用量(20 mg·60 kg-1·d-1)的7倍计算大鼠用量，浓度为0.62 g/mL，4℃冰箱冷藏备用，灌胃前加热。

1.5 跳台实验

各组大鼠于灌胃1周与4周末次30分钟后进行跳台实验。跳台装置为15 cm×30 cm×30 cm的被动回避反应箱，实验时先将大鼠放入箱中训练3分钟，然后通36 V交流电，记录每只大鼠第一次跳下安全区的时间(潜伏期)和错误次数。

1.6 Morris水迷宫

各组大鼠于灌胃1周与4周末次行Morris水迷宫实验，记录逃避潜伏期时间及穿越平台次数。(1)定位航行试验：将大鼠于第1象限入点处面向池壁放入水中，记录大鼠在120秒内寻找并爬上平台的时间，即逃避潜伏期时间，之后分别从其他3个象限入水点将大鼠放入水中，连续训练5天。(2)空间探索试验：于第6天撤去平台，在第1象限入点处将大鼠放入水中，记录大鼠在60秒内的运动轨迹，并计算其穿越平台次数。

1.7 下丘脑病理学观察

各组大鼠灌胃1周与4周末次，随机选择6只大鼠在行为学检测后麻醉处死，断头取脑组织投入预先配好的固定液(4%多聚甲醛)使其蛋白质变性凝固后，切取下丘脑部位进行常规固定、洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋，冠状切片、再脱蜡、水化、苏木素染色、伊红染色、常规脱水，透明，封片，观察大鼠下丘脑病理学变化。

1.8 HPT轴相关激素TSH、FT3、FT4的含量

各组大鼠灌胃4周末次，随机选择8只大鼠在行为学检测后麻醉大鼠，腹主动脉取血，4℃离心10分钟取血清，并用全自动放免计数仪按试剂盒说明的放射免疫法测定血清TSH、FT3、FT4含量。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 跳台实验

与正常组相比，假手术组大鼠灌胃1周与4周逃避潜伏期及错误次数均无明显差异(P>0.05)，VD模型组及VD中药组大鼠灌胃1周与4周逃避潜伏期时间显著下降，错误次数显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。与VD模型组相比，VD中药组大鼠灌胃1周与4周逃避潜伏期时间显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，错误次数在灌胃1周后统计无显著性差异(P>0.05)，灌胃4周后显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表1。

表1 颐脑解郁方对VD大鼠跳台实验的影响

2.2 Morris水迷宫实验

与正常组相比，假手术组大鼠灌胃1周与4周逃避潜伏期与穿越平台次数无明显差异(P>0.05)，VD模型组及VD中药组大鼠灌胃4周逃避潜伏期时间明显增多(P<0.05，P<0.01)；VD模型组大鼠灌胃1周穿越平台次数显著下降(P<0.01)，VD模型组及VD中药组大鼠灌胃4周穿越平台次数均明显下降(P<0.05)。与VD模型组相比，VD中药组大鼠灌胃1周与4周逃避潜伏期时间减少，穿越平台次数增多，但统计学无显著差异(P>0.05)。结果见表2、表3。

表2 颐脑解郁方对VD大鼠Morris水迷宫实验逃避潜伏期的影响

表3 颐脑解郁方对VD大鼠Morris水迷宫实验穿越平台次数的影响

2.3 下丘脑病理学观察

光镜显示，正常组大鼠灌胃1周下丘脑神经元细胞及神经胶质细胞排列有序，细胞核大，淡染，染色质分布均匀，核仁清晰，未见变性、坏死等病变，且灌胃4周与1周相比未见差异。与正常组相比，假手术组大鼠下丘脑病理形态变化不明显；VD模型组大鼠灌胃1周下丘脑见大片液化性坏死灶，呈筛网状结构，坏死区内神经元细胞变性、坏死，小胶质细胞增生明显及炎症细胞浸润，且大鼠灌胃4周较1周后下丘脑细胞变性、坏死程度更明显。与VD模型组相比，VD中药组大鼠灌胃1周下丘脑细胞变性程度减轻，但仍见大片液化性坏死灶，呈筛网状结构，坏死区内神经元细胞变性、坏死，小胶质细胞增生明显及炎症细胞浸润，且大鼠灌胃4周较1周下丘脑细胞变性减轻明显(见图1)。

图1 颐脑解郁方对VD大鼠下丘脑形态的影响(HE,×400)

2.4 HPT轴相关激素TSH、FT3、FT4含量测定

与正常组相比，假手术组大鼠血清FT3、FT4、TSH含量无统计学差异(P>0.05)；VD模型组、VD中药组大鼠血清FT3、FT4含量显著下降(P<0.05,P<0.01)，血清TSH含量明显升高(P<0.05，P<0.01)。与VD模型组相比，VD中药组大鼠血清FT3、FT4含量明显升高(P<0.05，P<0.01)，血清TSH含量显著下降(P<0.01)。结果见表4。

表4 颐脑解郁方对VD大鼠HPT轴相关激素TSH、FT3、FT4的影响

3 讨论

本实验选择改良版的线栓法造成大鼠脑血管性病变后4周不予任何干预，待其自然痴呆的VD模型更好的模拟了现实生活中人脑血管病变后出现痴呆的病况，避免了一系列复杂因素的影响[10]。跳台实验与Morris水迷宫实验是研究实验室啮齿类动物空间学习和记忆的常用方法[11]。本研究数据表明脑血管病变后随着病程的延长，VD大鼠的空间学习及记忆能力也逐渐下降，导致认知障碍，与临床VD患者不同阶段出现的反应迟钝、思维混乱、记忆模糊、智力障碍等症状表现类似[12]。

HPT轴的功能对中枢神经系统的发生、发展和正常功能的维持有重要的作用。研究表明，VD认知功能障碍的机制可能与海马组织的病理性损伤相关，而下丘脑是否损伤的报道研究甚少[13]。本研究通过HE染色技术观察大鼠下丘脑的病理形态，发现VD模型组大鼠下丘脑可见大片液化性坏死灶，小胶质细胞增生，大量炎症细胞浸润。临床研究表明，VD患者发生脑梗死病灶侵及基底节区等部位可引起HPT轴功能紊乱，垂体反应性不佳致TSH分泌不足时，甲状腺激素的合成及外周代谢发生障碍，血清中FT3、FT4显著降低，代偿性刺激TSH的分泌[14-16]。本课题组通过放射免疫法检测HPT轴相关激素水平发现，VD可导致FT3、FT4的含量减少，TSH含量升高，与先前研究一致[17]。

VD属中医学“呆病”“健忘”等范畴[18]。课题组认为此病的病变部位在脑，多肝肾不足，中医辨证多属肾虚肝郁证型。颐脑解郁方由刺五加、郁金、栀子、五味子组成，方中刺五加、郁金二药为君臣，两者配伍既益气补肾，填精益髓，又疏肝利胆，行气解郁，肾气足则脑髓渐充，肝气达则郁气自疏。栀子清解脑络痰浊瘀毒，五味子涩精滋肾安神，又可防郁金、栀子苦寒清泻过度，敛正气而不敛邪气，共为佐药[19]。本课题组先前研究表明，颐脑解郁方可改善VD大鼠学习记忆能力，其作用机制可能与调节大鼠脑内单胺类递质含量相关[20]。本次研究结果表明，颐脑解郁方可改善VD大鼠学习记忆能力，减轻下丘脑细胞变性、坏死程度，并能调节HPT轴的TSH、FT3、FT4含量。

综上所述，颐脑解郁方对VD认知功能有改善作用，机制可能与调节HPT轴相关激素TSH、FT3、FT4含量有关。