右美托咪定对老年患者单肺通气相关肺损伤及T G F-β1/S m ads通路的影响

王 磊，丁彦玲，冯 伟，王 兰，康 曼

（1.河北省保定市第一中心医院麻醉科，保定 071000；2.河北省保定市第一中心医院药剂科，保定 071000；3.河北省保定市职业技术学院医疗科，保定 071000）

随着老龄化程度的加重，行胸科手术的老年患者人数亦增多，胸科手术往往需单肺通气（onelung ventilation，OLV），但此操作会致通气/血流比例失调，及肺复张后因氧化应激和炎性反应造成的肺损伤[1-2]。转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路对细胞生长、免疫调节、炎性反应等有重要调节作用，其中TGF-β1是TGF-β含量最丰富、表达最多的亚型[3]。Smads是建立胞膜与胞核之间的信号转导通路[4]。研究[5]显示，TGF-β1/Smads信号通路激活炎性反应诱发肺损伤。右美托咪定可减轻机体炎性反应，减轻OLV所致的肺损伤[6-7]。本研究拟评价右美托咪定对胸腔镜OLV相关肺损伤及TGF-β1/smads信号通路的影响，为老年患者临床用药及围术期肺保护提供循证学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究已在中国临床研究注册中心注册（临床注册号：ChiCTR1900025040），经医院伦理委员会批准（批号：2019-011），并与患者或其家属签署知情同意书。选取2019年2月至2020年2月行择期全麻下胸腔镜肺叶（段）部分切除手术患者，性别不限，年龄65～80岁，体质量指数（body mass index，BMI）＜30 kg·m-2，美国麻醉师协会（American Society of Anesthesiologists，ASA）分级为Ⅱ级或Ⅲ级，无严重心脑血管疾病及慢性阻塞性或（和限制性）肺病，共80例。采用随机数字表法将其分为两组：右美托组和对照组。排除标准：手术时间＞4 h或OLV时间＜90 min；受试者中途拒绝继续配合实验或者死亡；实验室检查值因各种原因出现明显异常者；各种原因导致未严格执行实验方案者；围术期发生严重不良事件，如低氧血症（SpO2＜90%且时间＞3 min）、困难气道插管、窦性心动过缓或传导阻滞病史、恶性心律失常、过敏性休克等。其中右美托组有1例患者手术暂停，3例患者不同意进行本研究，1例出现低氧血症且时间＞3 min，1例术中出现窦性心动过缓，2例OLV时间＜90 min；对照组中有2例患者手术暂停，1例患者不同意进行本研究，2例出现低氧血症且时间＞3 min，2例手术＞4 h，1例OLV时间＜90 min。最终纳入右美托组32例，对照组32例。

1.2 麻醉方法

患者均无术前麻醉用药，入室后常规面罩吸纯氧，监测平均动脉压（MAP）、心率（HR）、心电图（ECG）、血氧饱和度SpO2和脑电双频指数（BIS），建立外周静脉通路。对侧肘静脉留置静脉套管备静脉采样，桡动脉穿刺采样并持续监测有创动脉血压。参照文献[8]并结合临床经验，右美托组于麻醉诱导前15 min，静脉持续泵入右美托咪定（批号：H20183219，扬子江药业集团有限公司）负荷量0.5μg·kg-1，继以0.3μg·（kg·h）-1的速率持续泵入至术毕前30 min，对照组给予等容量的生理盐水。两组麻醉诱导均采用静脉注射咪达唑仑0.04 mg·kg-1、舒芬太尼0.4μg·kg-1、异丙酚1.5 mg·kg-1、顺阿曲库铵0.15 mg·kg-1，诱导平稳后插入双腔支气管导管，纤维支气管镜辅助确定气管导管位置，接麻醉机行机械通气，设置潮气量为8 mL·kg-1，通气频率12次/min，吸呼比1∶2，呼气末正压（PEEP）为0 cm H2O，吸入氧浓度50%，维持呼气末二氧化碳分压（PETCO2）分压35～45 mmHg。麻醉维持以吸入七氟醚（1.0 MAC）为主，间断静注肌松剂，维持BIS值45～55，MAP、HR波幅不超基础值20%。OLV时潮气量为6 mL·kg-1，通气频率调整为12～15次/min，吸入氧浓度100%，PEEP为3 cm H2O，其他通气参数维持不变。

1.3 观察指标

1.3.1 记录患者基本情况及术中情况 包括患者的年龄、性别、体质量指数、ASA分级和术中情况的出血量、手术时间、OLV时间。

1.3.2 检测肺组织蛋白表达并观察肺病理损伤评分 术中肺叶离体时取肺组织，取远离病变处＞6 cm以上区域分别取两块5 mm×5 mm×5 mm大小标本。一块肺组织用Western blot检测肺组织TGF-β1、Smad2和Smad3的蛋白表达，将标本放置EP管中，加入蛋白裂解液对组织进行充分研磨，经静置离心后取上清液，用BCA蛋白浓度试剂盒对其进行蛋白定量，化学发光法显色；另一块肺组织切片包埋HE染色后，每张切片随机取10个高倍视野，在显微镜下进行肺病理损伤评分[9]，取平均值为每张切片的最后评分。

1.3.3 检测氧合指数（OI）及肺动态顺应性（Cdyn）于T0～3采集桡动脉血2 mL，经血气分析计算OI=PaO2/FiO2，于T1～3时计算Cdyn=VT/（Pmax-PEEP）。

1.3.4 ELISA法检测肺表面活性物质蛋白A（SPA）和TNF-α浓度 于T0～3时抽取外周静脉血，严格参照试剂说明书进行，采用ELISA检测外周血SP-A、TNF-α浓度（试剂盒由Becton Dickinson公司提供）。

1.3.5 qRT-PCR法检测TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA表达 于T0～3采集标本后用Ficoll分层液法分离外周血单个核细胞，加入Trizol试剂裂解提取总RNA，选择OD260/280值在1.6～2.0的总RNA标本。取1μg RNA作为模板用于cDNA的合成，流程严格参照逆转录试剂盒（上海生工生物工程有限公司）说明书进行。由上海生工生物工程有限公司对引物进行设计合成，见表1。采用PCR试剂盒（上海生工生物工程有限公司）进行real-time PCR，反应体系为20μL，包括2×real-time PCR缓冲液10μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA模板2μL，DEPC水补足致20μL。反应条件：95℃预变性5 min，93℃变性20 s，56℃退火20s，75℃延伸30s，进行40个循环。每个样本做2个复孔，以GAPDH为内参照基因，采用ImagePro-Plus6.0软件进行分析，以积分光密度值反映目的基因表达，用2-△△Ct（△△Ct=处理组平均△Ct-对照组平均△Ct）计算表达差异的倍数。用2-△△Ct表示目的基因相对表达量。

表1 基因扩增引物序列

表3 两组老年患者不同时间点OI和Cdyn的比较

表2 两组老年患者一般情况和术中情况各项指标比较

1.4 统计学方法

资料采用SPSS26.0统计学软件进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，两样本均数比较采用t检验，非正态分布计量资料以中位数及四分位间距［M（QL，QU）］表示，采用秩和检验（Z检验）；分类变量采用频率及百分比表示，采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组老年患者一般情况及术中各项指标比较

两组老年患者性别构成、年龄、BMI、ASA分级、手术时间和OLV时间比较差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表2。

2.2 两组老年患者不同时间点OI和Cdyn的比较

与同组T0比较，两组T1～3时的OI均降低（P均＜0.05）；与对照组比较，右美托组T1～3时OI、Cdyn均升高（P均＜0.05），见表3。

2.3 两组老年患者肺组织HE染色图片及病理损伤评分比较

光镜下，对照组肺泡间隔相对增厚，肺泡壁毛细血管扩张充血明显，伴有较多炎性细胞浸润，肺泡内粉红色渗出较多；右美托组肺泡结构相对完整，肺泡壁毛细血管扩张充血轻，伴炎性细胞浸润减少，肺泡内渗出较少，见图1。肺病理损伤评分对照组为（3.0±0.8）分，右美托组为（2.8±0.6）分，右美托组低于对照组（t=4.515，P=0.002）。

2.4 两组老年患者不同时间点SP-A和TNF-α浓度比较

与同组T0相比，T1～3时外周血SP-A、TNFα浓度均上升（P均＜0.05）；与对照组相比，右美托组T1～3时外周血SP-A、TNF-α浓度均下降（P均＜0.05），见表4。

图1 肺组织病理切片（HE×200）

表4 两组老年患者不同时间点SP-A和TNF-α浓度比较

2.5 两组老年患者不同时间点TGF-β1、Smad2和Smad3的mRNA表达比较

与同组T0相比，T1～3时TGF-β1、Smad2和Smad3的mRNA表达均上调（P均＜0.05）；与对照组相比，右美托组T1～3时TGF-β1、Smad2和Smad3的mRNA表达均下调（P均＜0.05），见表5。

2.6 两组老年患者肺组织中TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表达比较

与对照组相比，右美托组肺组织中TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白表达均降低（P均＜0.05），见表6。

表5 两组老年患者不同时间点TGF-β1、Smad2和Smad3的mRNA表达比较

表6 两组老年患者肺组织TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达比较

3 讨论

TGF-β1属于TGF-β超家族，其受体广泛分布于肺内多种细胞中，一旦受到外界刺激，气道及上皮细胞中的TGF-β1表达增强，抑制TGFβ1的生物活性会抑制肺损伤的过程[10]。Smads家族蛋白作为重要信号转导分子，可将TGF-β1信号及其受体结合后，以异聚体的形式从细胞表面受体转至细胞核内，调节靶基因转录，抑制免疫细胞增殖和淋巴细胞分化，并使炎性因子释放增多[11-12]。研究[13]表明，Smad2、3是与TGF-β1结合后，激活细胞质中的Smad2和Smad3，形成Smad2/3复合物进入细胞核中，促进肺损伤的发生。故本研究选择观察外周血及肺组织中TGF-β1、Smad2和Smad3的变化。

右美托咪定对肺有保护作用。本研究发现，与对照组比较，右美托组在T1～3时OI和Cdyn升高，肺组织病理学损伤评分降低，SP-A浓度降低，提示右美托咪定可改善老年患者OLV期OI及Cdyn，减轻肺损伤。

研究[14]显示右美托咪定通过抑制TGF-β1/Smads信号通路的激活，可减轻糖尿病肾病大鼠的肾损伤。Li等[15]实验发现通过抑制TGF-β1/Smads/ERK通路，可减少体内炎性因子的产生和释放，降低肺泡上皮的损伤并修复，从而改善LPS诱导的大鼠急性肺损伤。本研究结果显示，右美托组较对照组在T1～3时炎性因子TNF-α浓度降低，T1～3时外周血单核细胞中的TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA表达下调，肺组织中TGFβ1、Smad2、Smad3的蛋白表达降低，提示通过抑制肺组织TGF-β1/Smads信号通路可降低炎性反应，从而减轻OLV所致的肺损伤，推测其机制可能是右美托咪定抑制肺细胞中TGF-β1与其受体胞外段相结合[16]，抑制细胞质中的Smad2和Smad3形成Smad2/3复合物，干扰特定DNA序列的结合和调节转录因子，从而抑制前炎症因子TNF-α的合成[17]，进而减轻肺损伤。但肺损伤作用机制十分复杂，不仅是单一细胞因子起着独立作用，还有各种细胞因子和炎性介质的彼此作用，形成相互制约、相互协作的网络体系，共同调节肺间质的发生发展，这也是本课题组进一步的实验方向。

综上所述，行胸腔镜肺叶（段）部分切除术的老年患者应用右美托咪定，可减轻炎性反应，改善OLV相关的肺损伤，其机制可能与右美托咪定下调TGF-β1/Smads信号通路有关。