超临界流体色谱-串联质谱分离和测定烟草烯酰吗啉顺反异构体

杨 飞，纪 元，崔浩哲，王 颖，刘珊珊，邓惠敏，范子彦，边照阳，唐纲岭，李中皓

1.国家烟草质量监督检验中心，郑州高新技术产业开发区翠竹街6 号 450001

2.苏州科技大学化学生物与材料工程学院，江苏省苏州市高新区科锐路1 号 215009

3.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

烯酰吗啉是巴斯夫公司开发的一种新型内吸治疗性专用低毒杀菌剂［1］，其杀菌机制是通过破坏病菌细胞壁膜的形成，导致孢子囊壁的分解，从而使病菌死亡，主要用于预防和治疗葡萄、西红柿、烟草等农作物的霜霉病及晚疫病等［2］。由于其分子结构中含有C=C 双键，烯酰吗啉有两个顺反异构体（图1）。

尽管立体异构体具有相似的物理和化学性质，但却表现出截然不同的生物活性、毒性和其他性质［3-10］。如（Z）-辛硫磷对蚊虫幼虫的杀虫活性比（E）-辛硫磷高约3 倍［11］。Piao 等［12］研究了3 种土壤中烯酰吗啉的选择性降解，结果表明，（E）-烯酰吗啉的降解速度快于（Z）-烯酰吗啉。Fan等［13］也研究了葡萄中烯酰吗啉异构体的残留量和降解情况，发现（E）-烯酰吗啉的降解速度快于（Z）-烯酰吗啉。立体异构体之间具有相似的物理和化学性质，因此很难通过传统分析技术加以分离。在大多数情况下，立体异构体在常规分析中始终被视为一种化合物。非立体选择性分析仅能提供部分信息，而这些信息不能为农药的风险评估提供完整而可靠的数据。CORESTA 农用化学品咨询委员会制定的农用化学品指导性残留限量表中，烯酰吗啉［（E）-烯酰吗啉和（Z）-烯酰吗啉之和］的残留限量被定为2 mg/kg。由于立体异构体农药难以分离和纯化，因此市场上销售的大部分农药均是不同异构体的混合物。使用高活性异构体的农药，可以大大减少释放到环境中的农药总量［8］。因此，寻求一种新的、有效的立体选择性分离方法极具挑战性，同时，对促进评估这些农药对人类、动物和环境构成的风险具有重要意义。目前，已有文献报道高效液相色谱（HPLC）法可用于烯酰吗啉的立体选择性分析和测定［12］。但是，该方法分离效果差、保留时间长、灵敏度低，不适合常规分析。而且，分离过程中使用的大量有毒试剂（如甲醇、乙腈）对环境有害［14-15］。近年来，超临界流体色谱法（SFC）作为一种新的分析技术引起了研究人员的广泛关注［16-18］。由于SFC 使用低黏度的CO2作为主要流动相，其流速和分离速度均比HPLC 快。同时，SFC 仅使用少量的有机溶剂作为流动相的改性剂，有机溶剂消耗量低于HPLC［19-23］。这些优点使得SFC 成为立体异构农药分析的首选方法，已广泛应用于农药的立体选择性测定和分离［24-27］。因此，采用超临界流体色谱-串联质谱（Supercritical fluid chromatography-tandem mass spectrometry，SFC-MS/MS）立体选择性分离和测定了烟草中烯酰吗啉的顺反异构体，旨在为烯酰吗啉顺反异构体降解和代谢的进一步研究提供基础，并可能为其他农药的立体选择性分析提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

10 个烤烟实际样品全部来自2019 年度国家烟草专卖局农残普查分析样品。

烯酰吗啉标准品（＞98.0%，德国Augsburg 公司）；（E）-烯酰吗啉标准品、（Z）-烯酰吗啉标准品（＞98.0%，天津阿尔塔科技有限公司）；甲酸、甲醇、乙腈、乙醇和异丙醇（色谱纯，德国Chemicell 公司）；氯化钠、无水硫酸镁、N-丙基乙二胺（PSA）（AR，上海安普实验科技股份有限公司）；超纯水（自制，电阻率≥18.2 MΩ·cm）；高纯氩、高纯氮（＞99.99%，郑州源正特种气体有限公司）。

ACQUITY 超高效合相色谱仪、ACQUITY TQD 四极杆串联质谱仪（配电喷雾电离源）、Acquity UPC2 Trefoil CEL2 柱和Acquity UPC2 Trefoil AMY1 柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）（美国Waters 公司）；Chiralcel IG-3 柱和Chiralcel OD-3柱（100 mm×3.0 mm，3.0 μm）（日本Daicel 公司）；分样筛（孔径2 mm×直径10 cm，广东开平莱雪伦模具有限公司）；5810-R 高速离心机（美国Eppendorf 公司）；VX200 涡旋振荡仪（美国Labnet公司）；AEl63 电子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo 公司）；Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore 公司）；0.22 μm 有机相滤膜（上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

所有样品在40 ℃烘箱中烘烤24 h 后研磨，并使用孔径为2 mm 的分样筛过滤，过滤后的粉末样品贮存于棕色玻璃瓶中，于4 ℃下保存。

1.2.2 标准工作溶液

称取10 mg 烯酰吗啉标准品，用乙腈溶解并定容于10 mL 容量瓶中，得到一级标准储备液（1.0 mg/mL）。移取100 μL 一级标准储备液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，得到二级标准储备液（10.0 μg/mL）。移取适量的二级标准储备液并使用乙腈稀释，制备烯酰吗啉浓度为1 000、500、200、100、50 和20 ng/mL 的标准溶液（其中各异构体浓度为500、250、100、50、25 和10 ng/mL）。

取6 个1.5 mL 色谱瓶，分别加入200 μL 标准溶液和800 μL 乙腈，得到各异构体浓度分别为100、50、20、10、5 和2 ng/mL的溶剂标准工作溶液。

另取6 个1.5 mL 色谱瓶，加入200 μL 的标准溶液、600 μL 的乙腈和200 μL 的空白烟草提取物，得到各异构体浓度为100、50、20、10、5 和2 ng/mL的基质匹配标准工作溶液。所有溶液在-18 ℃保存。

1.2.3 加标样品的制备

空白样品在回收率实验中用作空白对照基质，并用于制备基质匹配的标准工作溶液，应确保不含烯酰吗啉。使用前，将空白烟草样品研磨均匀，并过孔径2 mm 分样筛，在室温下自然风干。通过添加相应体积的二级标准储备液制备不同质量分数的加标样品。然后在样品中加入10 mL 甲醇，并机械振荡10 min，以使目标物均匀分布在样品中。将样品放置于通风橱中过夜，使溶剂在室温下蒸发。

1.2.4 样品分析

参考文献［28］的方法对烟草样品进行QuEChERS 处理：称取2 g 烟草粉末样品于50 mL具塞离心管中，加入超纯水和乙腈，涡旋振荡3 min；然后再加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠，继续涡旋振荡3 min，静置；移取1 mL 上清液，加入1.5 mL 离心管中，再加入无水硫酸镁及PSA，涡旋振荡、离心；上清液经有机相滤膜过滤后，取200 μL 滤液，用800 μL 乙腈稀释，进行SFC-MS/MS 检测。分析条件：

色谱柱：Chiralcel OD-3 柱（100 mm×3 mm，3.0 μm）；动态背压：13.79 MPa；柱温：35 ℃；样品室温度：10 ℃；进样量：2 μL；流动相：A 相为CO2，B 相为甲醇；洗脱条件：等度洗脱，V流动相A∶V流动相B=98 ∶2；流动相流速：2.0 mL/min；补偿溶剂：0.1%（体积分数）甲酸的甲醇溶液，流速0.2 mL/min；离子源：电喷雾电离源（ESI）；离子源温度：150 ℃；毛细管电压：2.8 kV；锥空气流量：60 L/h；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流量：700 L/h；采集模式：多反应监测（MRM）；定量分析离子对（m/z）：388.1＞165.1（碰撞电压30 V，锥孔电压41 V）；定性分析离子对（m/z）：388.1＞300.9（碰撞电压20 V，锥孔电压41 V）；质谱扫描方式：正离子扫描。依据每个色谱峰扫描15～20 个数据点且自动调整停留时间。利用Mass Lynx 4.1 软件采集所有数据。

2 结果与讨论

2.1 立体选择性分离条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

考察了4 种不同的手性色谱柱（Acquity UPC2 Trefoil CEL2，Acquity UPC2 Trefoil AMY1，Chiralpak IG-3 和Chiralcel OD-3）对烯酰吗啉顺反异构体的分离能力，结果见图2。在4 种色谱柱中，Acquity UPC2 Trefoil AMY1 和Chiralpak IG-3柱不能分离顺反异构体。Acquity UPC2 Trefoil CEL2 和Chiralcel OD-3 柱均可实现顺反异构体的基线分离，但是Acquity UPC2 Trefoil CEL2 柱分离得到的色谱峰峰形不光滑且峰太宽（图2）。因此，在后续实验中选择Chiralcel OD-3 柱分离烯酰吗啉顺反异构体。

图2 利用4 种不同色谱柱分离烯酰吗啉异构体的SFC-MS/MS 色谱图Fig.2 Typical SFC-MS/MS chromatograms of dimethomorph isomers separated on four columns

2.1.2 改性剂的影响

极性的有机改性剂对异构体立体选择性分离的洗脱时间、分离度和洗脱顺序均有重要影响［29-30］。为了在Chiralcel OD-3 柱上实现顺反异构体的良好分离，考察了3 种不同有机改性剂（甲醇、乙醇和异丙醇）对顺反异构体分离的影响。结果（图3）表明，甲醇可以使两种异构体基线完全分离且色谱峰形良好（图3a）。相反，当使用乙醇时，烯酰吗啉两个异构体的峰形较差。使用异丙醇作为改性剂时，烯酰吗啉顺反异构体不能分开。因此，选择甲醇作为流动相改性剂。

图3 改性剂对烯酰吗啉异构体分离的影响Fig.3 Effects of modifiers on separation of dimethomorph isomers

2.1.3 柱温的影响

柱温一直是影响超临界流体色谱立体选择性分离的重要因素之一。超临界二氧化碳的密度和黏度随柱温升高而降低，导致流动相的洗脱能力下降，保留时间增加［31］。考察了柱温从35 ℃逐步升高到50 ℃（步长为5 ℃）时，烯酰吗啉顺反异构体的分离情况。结果如图4 所示，保留时间随温度升高而增加。温度对烯酰吗啉顺反异构体分离度的影响较小，但是当温度从35 ℃升至40 ℃时，MS 响应信号明显降低。考虑到保留时间和MS 响应信号，选择35 ℃为最佳分离温度。

图4 柱温对烯酰吗啉异构体分离效果的影响Fig.4 Effects of column temperature on separation of dimethomorph isomers

2.1.4 动态背压的影响

随动态背压升高，超临界CO2流体密度增加，其对分析物的溶解和洗脱能力也随之增强，因此目标物的保留时间减小［32］。考察了动态背压从11.03 MPa 逐步增加至15.17 MPa（步长为1.38 MPa）时，烯酰吗啉顺反异构体的分离情况。结果（图5）表明，动态背压的变化对顺反异构体的分离度没有影响；但是，动态背压从11.03 MPa 增加到13.79 MPa，会导致MS 响应信号显著增加。因此，选择动态背压13.79 MPa 作为推荐值。

图5 动态背压对烯酰吗啉顺反异构体分离情况的影响Fig.5 Effects of ABPR（auto back pressure regulator）on separation of dimethomorph isomers

2.1.5 烯酰吗啉异构体的洗脱顺序

在上述最优化的实验条件下，分别将（E）-和（Z）-烯酰吗啉标准溶液注入SFC-MS/MS 系统中，（E）-烯酰吗啉和（Z）-烯酰吗啉在Chiralcel OD-3 柱上的洗脱顺序依次为（E）-烯酰吗啉（3.68 min）、（Z）-烯酰吗啉（4.15 min）。在最优条件下，烟草实际加标样品的选择离子色谱图如图6所示。

图6 加标样品的典型SFC-MS/MS 色谱图Fig.6 Typical SFC-MS/MS chromatogram of the spiked tobacco sample

2.2 方法验证

2.2.1 基质效应

基质效应（ME）是由共洗脱的基质组分产生的，这些组分会影响目标分析物的电离，在某些情况下会导致目标分析物离子抑制或离子增强［33］。通过溶剂标准工作溶液与基质匹配标准工作溶液进行比较研究基质效应。如表1 所示，（E）-烯酰吗啉和（Z）-烯酰吗啉的基质效应分别为-59.8%和-69.3%，表明其信号被强烈抑制。因此，使用基质匹配的标准工作曲线进行定量以获得准确结果。

2.2.2 线性方程、检出限和定量限

通过分析溶剂标准工作溶液和相应的基质匹配标准工作溶液（2～100 ng/mL）考察方法的线性。通过绘制顺反异构体峰面积与浓度的关系图生成校准曲线。通过使用低浓度的加标样品确定方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），分别以信噪 比（S/N）为3 和10时的浓度定义为LOD 和LOQ。如表1所示，各异构体线性关系良好（R2≥0.994 3），（E）-烯酰吗啉和（Z）-烯酰吗啉的LOD和LOQ 均较低，可以满足定量分析的需要。

表1 烯酰吗啉顺反异构体的线性方程、基质效应、检出限和定量限Tab.1 Regression equation，matrix effect，LODs，and LOQs for the isomers of dimethomorph

2.2.3 准确度和精密度

回收率实验用于评估该方法的准确性和精密度。制备3 个不同浓度（分别为0.02、0.2 和2.0 mg/kg）的加标样品，依据上述步骤提取和净化，每个浓度样品平行测定5 次，连续测定3 d。使用相对标准偏差（RSD）评估该方法的精密度。如表2 所示，在所有加标水平下均获得满意的平均回收率（87.3%～102.3%）。方法的日内精密度（n=5）和日间精密度（n=15）分别为2.7%～4.9%和3.3%～5.9%。

表2 方法的准确度和精密度Tab.2 Accuracies and precisions of the proposed method

2.3 方法的应用

采用本方法测定了10 个来自不同产区的烟草样品，结果显示：仅在1 个样品中检出（E）-和（Z）-烯酰吗啉，二者的质量分数分别为1.18 和1.22 mg/kg。该结果也表明，烯酰吗啉在烟草上施用时是以异构体混合物的形式存在的。

3 结论

①建立了超临界流体色谱-串联质谱分离和测定烟草中烯酰吗啉顺反异构体的方法，该方法主要以CO2为流动相，在5 min 内即可实现烯酰吗啉顺反异构体的基线分离。②在最优化的分离条件下，烯酰吗啉顺反异构体的回收率在87.3%～102.3%之间，日内精密度为2.7%～4.9%，日间精密度为3.3%～5.9%。③该方法具有绿色、快速、灵敏度高、选择性强、稳定可靠的优点，已成功应用于分离和测定烟草实际样品中的烯酰吗啉异构体。