TNF-α和TGF-β1基因多态性与关节假体无菌性松动、假体周围骨溶解的相关性分析*

吴国忠 王文怀 黄 隆 方凯彬 施劲楠

福建医科大学附属第二医院骨科，福建省泉州市 362000

人工关节置换手术已经成为医学领域中一项非常重要且已发展成熟的外科技术，但人工关节置换术后10年仍约有10%患者会出现假体无菌性松动、假体周围骨溶解现象。目前病因尚不明确，文献报道导致人工髋关节松动的原因大致可分为机械因素和生物学因素两大类。机械因素包括：假体设计、术中操作、应力遮挡等；生物学因素主要包括：假体材料及其产生的磨损颗粒所引起的无菌性炎性反应。磨损颗粒诱发假体周围组织产生一系列生物学反应是导致假体周围骨溶解、假体无菌性松动的主要原因，但机制目前还未明确。大部分关节假体可长期生存，但相同使用年限，不同个体发生骨溶解程度及概率并不相同，严重程度也差别明显。除了年龄、性别、营养状态、活动水平、生化代谢差异对关节置换术后假体无菌性松动、骨溶解存在影响外，个体的遗传因素在磨损颗粒引发的慢性炎症识别、反应也具有差异性。已有的研究证实多种基因单核苷酸多态性，不同基因表型与假体松动、假体周围骨溶解相关，说明不同的基因表型在磨损颗粒导致骨溶解的炎症反应存在差异性，不过目前这些研究的对象均为欧洲高加索人种且样本量较小，缺乏有关亚洲及中国人群的研究。巨噬细胞吞噬磨损颗粒，释放多种细胞因子，引起一系列炎症反应，其中TNF、TGF作为炎症因子，在炎症免疫中起着重要作用，但由于个体之间对聚乙烯磨损颗粒的反应存在很大差异[1]，只有少部分患者发生假体无菌性松动、假体周围骨溶解。这种个体差异是否与TNF-α、TGF-β1基因多态性相关，目前尚不明确。为此笔者采用病例对照回顾性分析研究的方法，探讨了TNF-α基因238 G/A位点[2]、TGF-β1基因+869T/C、+915G/C位点的单核苷酸多态性[3]与人工髋关节假体无菌性松动、假体周围骨溶解是否存在相关性。现将研究报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年8月1日—2020年12月31日在我院随访到的人工髋关节置换术后假体松动、假体周围骨溶解患者共20例作为观察组。纳入标准：(1)经临床症状、体格检查及影像学检查综合评估，符合髋关节假体无菌性松动、假体周围骨溶解诊断标准[4-6];(2)均自愿参加本次研究并签署知情同意书。排除标准：(1)假体周围感染导致的假体松动病例；(2)不愿参加研究。同期另取我院髋关节置换术后随访5年以上，并且假体牢固的患者30例作为对照组。所有研究对象均为福建地区汉族人，其职业、文化程度不限。两组患者的一般资料比较无统计学差异(P>0.05)，见表1。本研究方案获得医院伦理委员会的批准，所有入院患者均签署知情同意书。

表1 两组患者的一般情况比较

1.2 仪器及试剂 本研究采用下列仪器及试剂：高速低温离心机(5840R，Sigma公司)；T100 PCR仪(BIO-RAD公司)；全自动凝胶成像仪(北京赛智创业科技有限公司)；水平电泳装置(北京市六一仪器厂)；JA-2003电子分析天平(沈阳龙腾电子有限公司)；海尔MI-2270M(N)微波炉(青岛海尔集团)；微量紫外—可见光分光光度计[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，2×TransStart FastPfu PCR SuperMix(-dye)，Agarose，GelStain，DNA Loading buffer，Trans2K DNA Marker(北京全式金有限公司)；血液基因组 DNA 提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；无水乙醇(西陇科学股份有限公司)。

1.3 实验材料和方法

1.3.1 提取基因组：抽取患者外周静脉血2ml，置入含乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂的真空无菌管中混匀，-80℃保存备用。参照说明书用血液基因组DNA 提取试剂盒提取基因组。(1)将-80℃冻结的样品拿出后，室温解冻。(2)加20μl Protein K，500μl BB3及10μl Rnase A于2ml 的样品中，涡旋15s混合均匀，室温孵育10min。(3)短暂离心，将全部的溶液加入离心柱中，12 000g离心1min，弃流出液。(4)加入500μl溶液CB3，12 000g离心30s，弃流出液。(5)加入500μl溶液WB3，12 000g离心30s，弃流出液。(6)再加入500μl溶液WB3，12 000g离心30s，弃流出液。(7)12 000g离心2min，彻底去除残留的WB。(8)将离心柱置于一个干净的1.5ml离心管中，在柱的中央加入50～200μl预热的EB(60～70℃)，室温温育1min，2 000×g离心1min，洗脱DNA。(9)提取的DNA可直接用于各种下游应用实验，如不立即使用，请于-20℃保存。

1.3.2 引物设计及合成：在NCBI的Gene数据库中找到TNF-α基因及TGF-β1基因序列。查询TNF-α基因ID为7124，根据基因序列设计引物序列，TNF-α(238)设计上游为 5’-GCCCCTCCCAGTTCTAGTTC-3’，下游为 5’-TCATCTGGAGGAAGCGGTAG-3’，片段大小319bp。查询TGF-β1基因ID为7040，根据基因序列设计引物序列，TGF-β1(869和915)上游为5’-GCATCCTAGACCCTTTCTCCTC-3’，下游为 5’-TGGCGTAGTAGTCGGCCTC-3’，片段大小621bp。

1.3.3 PCR技术：将提取的cDNA稀释5倍作为PCR的模板，按2×TransStart FastPfu PCR SuperMix(-dye)的说明书配制qPCR反应液，总反应体系20μl。反应程序如下：95℃预变性2min；变性95℃ 20s，退火60℃ 20s，72℃ 15s，共30个循环；72℃延伸5min。使用T100 PCR仪，扩增目的基因。根据引物设计及合成，得知TNF-α包含238位点的基因片段大小为319bp，TGF-β1包含+869和+915位点的基因片段大小为621bp。利用设计合成的引物成功扩出了目的基因片段。

1.3.4 PCR产物测序：一代测序Sanger法即双脱氧末端终用做止法，对每个样品的pCR扩增产物进行测序，用DNAMAN8软件分析比较DNA测序结果，确定观察组及对照组样本TNF-α(238G/A)，TGF-β1(+869T/C和+915G/C)3个基因位点的基因型。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件分析处理所得数据，两组数据比较采用χ2检验，P<0.05时有统计学差异。

2 结果

对TNF-α基因238G/A位点基因型分析，由于AA基因型理论数<1，采用Fisher确切概率法进行统计结果分析，得出P>0.05，提示差异无统计学意义，尚不能认为观察组、对照组TNF-α基因238G/A位点基因型存在相关性。TGF-β1+869T/C、+915G/C两个基因位点未发现SNP多态性。两组基因型分布情况见表2。

表2 两组基因型分布情况

3 讨论

3.1 关节假体无菌性松动、假体周围骨溶解的病因探讨与处理 关节假体无菌性松动、假体周围骨溶解是初次人工关节置换术后失败和翻修手术最常见的原因[7]，其病因尚不清楚。有研究认为磨损颗粒在假体周围无菌性松动、骨溶解起到关键作用[8-9]。磨损颗粒通过吞噬作用或模式识别受体作用于巨噬细胞，引起多种趋化因子和炎性介质释放,启动骨质溶解的进程[10]。磨损颗粒引发的骨溶解本质上是异物排斥反应的一种。磨损颗粒被巨噬细胞吞噬后，产生一系列炎症因子，诱导骨溶解及无菌性松动，而大的颗粒虽不被吞噬，但能被巨噬细胞所包裹，同样能刺激巨噬细胞分泌炎症因子，引起炎症反应。要控制骨溶解现象，需减少磨损颗粒的产生及其生物学反应。植入物设计、手术因素、患者因素均对磨损颗粒的形成造成影响。优化设计和改良关节假体材料，提高耐磨性，规范手术操作，降低患者体重指数，避免关节置换术后过度使用，药物治疗，均是减少磨损颗粒的重要手段。

3.2 TNF-α、TGF-β1与关节假体无菌性松动、假体周围骨溶解 有研究提出与骨关节炎患者不同，髋关节假体无菌性松动患者局部有特殊的炎症反应和神经支配现象，提示神经免疫相互作用，揭示潜在的作用机制及靶向治疗手段，以改善髋关节假体的寿命和治疗假体无菌性松动[11]。炎症细胞因子TNF-α、TGF-β1是重要的影响骨代谢的因子，在假体周围骨溶解的慢性炎性骨吸收发挥了重要作用。人类基因转录活性的升高或降低与该基因启动子中的SNP有关，蛋白质编码区的SNP可能会使其翻译后关键的功能基团氨基酸序列发生变化，使蛋白质结构发生变化，影响蛋白质的功能，导致人体对特定环境或病因的敏感性增加，从而致病。

TNF-α是一种主要由单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞分泌，且有广泛生物学活性的细胞因子，广泛参与诱导炎症和免疫调节。启动子区的基因多态性与基因转录活性增强及基因水平的增加有关，在TNF-α启动子238位点等位碱基呈现多态性，有GG、GA、AA 3种不同基因型[12]。本研究中TNF-α 238观察组 GG基因型18例，AA基因型2例，对照组30例基因型均为 GG，两组基因型数据对比无统计学差异，故不能认为TNF-α 238单核苷酸多态性与关节假体无菌性松动、假体周围骨溶解存在相关性，即还不能认为TNF-α 238(G/A)位点AA基因型是关节假体松动、周围骨溶解的遗传危险因素。

转化生长因子(TGF-β1)是一个多效的细胞因子，影响细胞的生长、分化和细胞外基质的合成，是重要的骨代谢调节剂，调节成骨细胞生化与增殖，抑制破坏细胞前体的形成及骨吸收。该TGF-β1基因定位于染色体19q13，具有遗传多态性，由7个外显子和6个内含子组成，编码区的基因多态性可引起编码蛋白的差异，影响疾病的产生或严重程度。TGF-β1基因SNP的存在可能通过影响TGF-β1在血清中的表达量，影响假体周围局部骨质代谢，使骨细胞功能受损，引起假体周围骨溶解、假体松动的发生。目前研究发现TGF-β1至少存在8个常见基因多态性位点，其中+869T/C以及+915G/C是研究较多的2个基因多态性位点。TGF-β1在体内产生量的多少可能与TGF-β1+869，+915位点的基因多态性相关[3]。但在本研究中观察组及对照组TGF-β1基因+869 T/C位点均为CC基因型，在+915G/C位点均为GG基因型，暂未发现基因多态性，故不能认为TGF-β1+869、+915位点的单核苷酸多态性与关节假体无菌性松动、骨溶解发病存在相关性。

3.3 本研究的潜在价值 目前关节假体植入后骨溶解现象尚无有效的生物学检测指标，无法进行早期干预治疗，并且无法有效评估治疗效果，故当患者出现明显松动症状而就诊时，通常原关节假体已无法保留，只能依靠翻修手术恢复关节功能。本研究目的讨论分析TNF-α 238G/A、TGF-β1+869T/C、+915G/C共3个基因位点的单核苷酸多态性与关节假体无菌性松动、假体周围骨溶解发病风险的相关性，为其发病寻找危险遗传基因类型提供科学依据，当相关危险易感基因明确后，可早期预警，提前药物介入或在基因个体化治疗提供新思路，应用价值巨大。

在关节假体植入术前，检测关节假体无菌性松动、假体周围骨溶解发病相关的危险遗传基因类型，提前干预，降低宿主对磨损颗粒的慢性炎症反应。如可通过选择特殊类型关节假体，有文献用地塞米松作为抗炎药物洗脱的人工关节种植系统相关研究，以防止磨损颗粒引起的假体周围骨溶解[13]，或选用重组人骨形态发生蛋白-2特殊涂层的股骨柄假体以降低假体松动风险[14]。对已经行人工关节置换的患者，检测相关危险遗传基因类型，对具有危险因素患者可提前药物介入处理，通过抑制骨吸收、促进骨生成和抑制炎症反应，可选择双膦酸盐类药物、骨形态发生蛋白、他汀类药物、TNF-α拮抗剂及环氧化酶抑制剂等。已有文献报道基因治疗的相关研究，由慢病毒介导的靶向TNF-α基因的shRNA基因治疗可能为无菌性关节松动提供一种新的治疗方法[15]。

3.4 本研究的局限性及改进方向 本研究具有一定的局限性，样本量小，只限于福建地区汉族人群，仅探讨了观察组与对照组TNF-α 238、TGF-β1基因+869、+915共3个位点的单核苷酸多态性，本实验没有涉及观察组与对照组中患者TNF-α、TGF-β1的分子表达水平差异，也没有涉及两组患者免疫细胞的炎症反应差异。因此，该研究需要增加样本量，增加不同地区人群，扩大基因检测位点，并对关节假体无菌性松动、假体周围骨溶解发病与易感基因型是否相关，在分子表达水平、细胞反应水平上作更深入研究。目前本研究结果尚不能认为这3个基因位点单核苷酸多态性与关节假体无菌性松动、假体周围骨溶解发病存在相关性，因为影响关节假体长期生存的遗传因素可能有多种基因参与，最终结果可能是由多种基因参与的结果，文献报道假体周围骨质溶解的个体差异性可能与IL-1RA基因、IL-6基因、基质金属蛋白酶—基因的单核苷酸多态性有关[10]。但目前由于人力、研究经费的限制，进一步开展此类相关研究难度较大。

综上所述，目前尚不能认为TNF-α 238、TGF-β1+869、+915位点的单核苷酸多态性与关节假体无菌性松动、假体周围骨溶解发病存在相关性，其发病可能潜在易感基因有待进一步深入研究明确。