酶联免疫法测量动物尿液中莱克多巴胺含量的不确定度分析

卢寿康，胡凤霞，叶惠仪，邱诗婷

（广东省东莞市万江农业技术服务中心，广东东莞 523000）

1 前言

酶联免疫法（ELISA）是应用在动物尿液、组织或饲料中的莱克多巴胺（瘦肉精）检测的一种快速筛选方式，随着近年来莱克多巴胺酶联免疫法试剂盒质量的提高，能够定量或半定量测定样品中莱克多巴胺含量。测量不确定度示表征测量值所处量值范围内的参数，可以反映数据的不确定程度以及可信程度[1-2]，是与现有可利用知识相应的最佳值接近程度的一种估计。迪恩生物有限公司提供的质检报告，校正曲线在0～8.1ng／mL范围内精密度为CV为0.36%～5.37%。虽然该方法为莱克多巴胺的筛选方法，但鉴于能够定量或半定量测定，研究者认为该方法测量结果准确性的影响因素有做合理分析的必要性，应该分析寻找主要影响因素并算出其所测结果的不确定度来对所测结果做准确可靠性评估。

莱克多巴胺是动物性食品中常有的激素类添加剂，近几年我国进出口岸对入境口岸食品中的检测多次测出莱克多巴胺。正常剂量的瘦肉精药物进入动物体内后可以通过新陈代谢排出，但过量摄入后该激素类添加剂用于动物饲料中后在动物体内会有大部分激素残留，不仅对动物机体有负面影响，对消费者的身体健康也有很大危害。

2 方法

2.1 试验方法

将莱克多巴胺酶联免疫试剂盒在22℃～25℃放置1h以上。猪尿样以3000rmp/min的速度离心3min。向莱克多巴胺微孔板中加入50μL系列标准/猪尿样品，立即向所有孔中加入100μL酶标工作液，轻轻晃动反应板几秒钟，在22℃～25℃孵育10min，倒出微孔中的液体。将所有微孔放入洗板机中洗板4次，每次每孔用250μL清洗液。将微孔板倒置在吸水纸上，拍干或用脱水仪脱水，加入100μL显色剂，摇匀反应板，22℃～25℃显色10min，最后加入100μL终止液。10min内在酶标仪450nm波长下测量吸光度值。

2.2 测定结果数学模型

式中：B为样品在450nm下的吸光度；

B0为零标准在450nm的吸光度；

x为样品中莱克多巴胺的浓度，μg/L；

a，b为线性曲线的拟合系数。

3 不确定度的来源分析

用鱼骨图表示如下：

3.1 移液器加样引起的不确定度u（fv）

a.加入50μL标准溶液/样品的不确定度；b.加入100μL酶标工作液的不确定度；c.温度效应产生的不确定度；B类评定，按均匀分布。

3.2 试剂盒标准品的不确定度u（c）

在0～8.1ng／mL范围内精密度为CV为0.36%～5.37%。包括厂家配液时使用的移液器、溶液温度变化，标准物质的最大允许差所引起的不确定度；B类评定，按均匀分布。

3.3 试剂回收率引起的不确定度u（Rec）

通过迪恩生物有限公司样品检测限及回收率实验（说明书介绍有数据）或本实验室进行样品检测限及回收率实验求得回收率；B类评定，按均匀分布。

3.4 酶标仪测定OD值u（f（A））产生的不确定度

依照校准证书，酶标仪在450nm测定范围0.220-1.342A时，仪器的误差分别为0.001、0.000A、-0.003A、0.000A；校准证书上显示的测量结果的扩展不确定度U=0.02，k=2。

3.5 样品重复测量的不确定度u（RSD）

使用3个梯度的加标样品和1份猪尿样品分别进行重复测量8次，A类评定，通过贝塞尔公式计算。

3.6 吸光度与浓度转换引入的不确定度u（f（x））

经迪恩生物有限公司ELISA数据处理系统作出“相对吸光度——浓度对数”拟合曲线，求得拟合曲线的标准偏差（SD值），A类评定，通过最小二乘法计算。

4 不确定度分量的量化

4.1 移液器加样造成的不确定度u（fv）

4.1.1 移液器容量误差产生的标准不确定度u（P）。查JJG646-2006《移液器检定规程》可调式移液器在50μL检定点的容量允许误差为±3%，按均匀分布计算，U（P50）在100μL检定点的容量允许误差为按均匀分布计算，

4.1.2 温度效应造成的标准不确定度u（T）。按规定容量器皿的校准在20℃下进行，水的膨胀系数为 2.1×10-4/℃，假设实验室的温度在 23.5±1.5℃之间波动。由于溶液在不同温度下，密度不一样，体积也发生变化，根据溶液的种类及浓度从校正表中查出23.5℃水的补正值A，实际体积

按均匀分布，加样为49.9655μL、99.931μL由温度效应引入的标准不确定度为：

4.1.3 相对合成标准不确定度由于u（P）和u（T）相互独立，故

整个实验过程中分别有样品50μL、酶标工作液100μL、显色剂100μL和终止液100μL四步加样步骤，四者分别是相互独立的关系。

4.2 试剂盒标准品的不确定度u（c）

杭州迪恩生物有限公司提供的质检报告给出的标准品浓度在0～8.1ng／mL范围内精密度（相对标准偏差）CV为0.36%～5.37%），则u（c）=5.37%=0.0537。

4.3 试剂回收率u（Rec）引起的不确定度

浙江迪恩生物科技股份有限公司的提供的说明书，尿液样品该试剂盒的回收率为90±20%，按均匀分布。则u

4.4 酶标仪测定OD值u（f（A））引起的不确定度

MULTISKANFC酶标仪在450nm的吸光度示值的最大允差为±0.03A，校准证书上显示的测量结果的扩展不确定度

4.5 样品重复测量的不确定度u（RSD）

使用3个梯度（1.1ppb、2.2ppb、5.5ppb）的加标样品和1份猪尿样品分别进行重复测量8次，并剔除认为无效的数据[6]。表1数据显示，4个样品测量的相对标准偏差RSD不大于15.1%。鉴于日常检测中同一样品做两次平行测量，以2次测量的平均值作为被测量的估计值，

表1 样品重复性测量结果

4.6 吸光度与浓度转换u（f（x））引入的不确定度

使用杭州迪恩生物有限公司提供的ELISA数据处理系统，通过对6组试剂盒标准品重复测量2次，测得的吸光值，将所有标准品的B/B0在半对数系统里依次输入，根据每个标准品对应的不同浓度，可以得出图1的标准曲线，样品的B/B0值在标准曲线中能找到对应的莱克多巴胺的浓度。通过分析得到莱克多巴胺的线性回归方程，表示为Y=-0.1507X+0.4938，其中，斜率为-0.1507，截距为0.4938，相关系数｜R｜=0.9934，具有良好的线性相关性[7]。经ELISA数据处理系统通过最小二乘法求得曲线的SD值为0.13，

5 合成标准不确定度

不确定度分量列表于下：

莱克多巴胺相对合成不确定度：

当样品中莱克多巴胺的浓度x为0.2123μg/L时，Ux=urel×x=0.1920×0.2123=0.0408μg/L

6 扩展不确定度

按照惯例，取扩展因子k=2，则扩展不确定度为Uk=Ux×k=0.0408μg/L×2=0.0816μg/L

7 结果报告

按照农业部1025公告-6-2008《动物性食品中莱克多巴胺残留检测酶联免疫吸附法》，测定猪尿中莱克多巴胺的平均含量0.2123μg/L，Uk=0.0816μg/L，k=2。