改性壳聚糖复合膜的制备及优化

李金星，沈春红，黎先发

（西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳 621000）

壳聚糖是一种天然高分子聚合物，具有良好的成膜性和抗菌性，以及许多独特的物理化学特性和生物功能，由于壳聚糖分子间和分子内的氢键导致溶解性差以及抑菌性不足等影响，使得它的应用在一定程度上受到了限制[1]。利用壳聚糖分子中游离的氨基和羟基能进行许多化学反应，可以对壳聚糖进行化学改性，这些衍生物都具有良好的成膜性、吸湿性[2]、粘附性[3]和生物可降解性[4]等。

巯基化壳聚糖，不仅具有壳聚糖本身的优异性质，还具有良好的水溶性，改善了壳聚糖不溶于水的局限，应用范围更广，此外其具备强大的粘附性[5-6]且无生物毒性。壳聚糖上巯基的接入方式有很多，合成方法大都是在壳聚糖的氨基上接含巯基的基团。Kast 等[7]将巯基乙酸（TGA）在碳二亚胺的作用下，以共价方式连接到壳聚糖上，由此制备的巯基化壳聚糖表现出高达10 倍的粘附性改善，这是通过在聚合物的伯氨基和TGA 的羧酸基之间形成酰胺键来实现的；Kafedjiiski 等[8]用S-乙酰硫代亚胺酸异丙酯对壳聚糖进行化学修饰，通过硫醇基团的固定化，粘液糖蛋白与粘液糖蛋白形成二硫键，大大改善了粘液粘附性；王凯丽[9]以生物体内唯一含有巯基基团的半胱氨酸的乙酰产物N-乙酰-L-半胱氨酸为亲水基团，对壳聚糖进行改性，合成具有更好粘附性、生物相容性和无毒副作用的巯基壳聚糖衍生物。尽管进行了化学修饰，但它们仍然是可生物降解的，并表现出良好的溶胀行为。巯基化壳聚糖不仅在生物医药方面作为医用敷料及药物载体具有广阔的前景[10]，在水果保鲜方面，作为新型水果保鲜剂，可制备为固体保鲜剂，也可制备为保鲜液涂膜于水果表面[11]，表现出明显的保鲜作用。

单一的可食膜存在机械性能不足以及抑菌效果差等问题，在一定程度上限制了应用范围，为了解决这个问题，目前最常用的方法就是将单一膜进行复合改性，利用物质之间的相互作用，提高膜的机械性能以及抑菌性能。为了提高膜的机械性能，通常将两种或两种以上的多糖、蛋白质共混，将不同的成膜材料采用物理或化学的方法根据不同的比例复配，结合不同成膜材料的优点，改善单一成膜材料的性能，从而得到具有优良性能的复合膜材料[12]。结冷胶是一种带负电荷的线性胞外多糖，具有独特的凝胶特性和溶液流变学性质[13]，以及良好的生物相容性和降解性。天然结冷胶主链上接有酰基，所形成凝胶柔软、富有弹性、且黏着力强。此外，结冷胶膜机械性能和透明度较好，结构稳定[14]。结冷胶作为带负电荷的多糖，它可以与壳聚糖等带相反电荷的聚合物产生聚电解质。壳聚糖聚合物本身在低pH 条件下的不稳定性限制了其应用，其后果是生物活性化合物比预期更早释放。壳聚糖的稳定性可通过与阴离子多糖如结冷胶的络合来提高，这种阴离子多糖在低pH 下能抑制药物释放[15]。Shukla 等[16]以聚乙二醇（PEG）为交联剂合成的结冷胶接枝壳聚糖水凝胶，在药物包封率、溶胀度、缓释性能和伤口愈合应用方面显示出巨大的效果。Liu 等[17]制备了壳聚糖纤维接枝结冷胶水凝胶，含有丰富的极性和亲水性氨基，具有较高的活化能，力学性能和持水性能优良，可用于制备支架材料。甘油作为增塑剂对膜的柔韧性和阻隔性能有重要的影响，增加膜结构的完整性[18]。氯化钙作为交联剂能够增强膜的机械性能，提高膜的稳定性[19]。钙离子在植物生长发育、成熟衰老等生理生化方面具有重要的作用，用于李[20]、葡萄[21]、梨[22]、枣[23]等水果保鲜中，可保持果实的硬度，延缓后熟衰老，降低腐烂率、维持果实品质。纳他霉素作为抑菌剂，无臭无味，对几乎所有霉菌和酵母菌具有抑制作用[24]。虽然壳聚糖与结冷胶的复配多有研究，常应用于生物医药方面[25-26]，而巯基化壳聚糖与结冷胶复配制备高性能复合膜尚未见报道，因此本研究为巯基化壳聚糖与结冷胶的复配在水果保鲜领域的应用提供理论依据。

本研究以壳聚糖为原料，利用壳聚糖上的氨基与N-乙酰L-半胱氨酸的羧基反应脱去一分子水，使两者键合到一起，从而使壳聚糖上连接上巯基，得到巯基化壳聚糖。以巯基化壳聚糖为成膜基质，添加结冷胶、甘油、氯化钙以及纳他霉素，制备机械性能良好的巯基化壳聚糖复合膜，为进一步研究该复合膜在水果保鲜中的应用提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

壳聚糖 食品级，河南信和生物科技有限公司；结冷胶、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）上海麦克林生化科技有限公司；甘油、氯化钙 分析纯，成都市科龙化工试剂厂；纳他霉素 食品级，河南圣斯德实业有限公司；6-氯-1-羟基苯并三氮唑（HOBt）、1-（3-二甲基氨丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDAC）上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

DF-101 集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；FreeZone2.5真空冷冻干燥机 美国Thermo Electron 公司；C45.504温控式电子万能材料试验机 美特斯工业系统（中国）有限公司；UV-8000S 紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；艾瑞泽数显千分尺 青岛易购五金工具有限公司；DHG-9145A 电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；KQ5200B 超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 巯基化壳聚糖的制备 参考王凯丽[9]巯基化壳聚糖的制备方法。

1.2.2 巯基化壳聚糖中巯基含量的测定 参考王凯丽[9]巯基化壳聚糖中巯基含量的测定方法。

1.2.3 单一膜及巯基化壳聚糖复合膜的制备 通过溶液流延法制成。单一壳聚糖膜的制备，将0.2 g 壳聚糖置于100 mL 去离子水中，搅拌至溶解，得到壳聚糖膜液，然后超声脱气30 min，取20 mL 壳聚糖膜液倾倒在90 mm 的培养皿中流延成膜，在30～50 ℃烘箱中烘干6 h，揭膜，得到单一壳聚糖膜。单一巯基化壳聚糖膜的制备与单一壳聚糖膜制备方法相同。巯基化壳聚糖复合膜的制备，将结冷胶置于100 mL 去离子水中加热溶解，再加入巯基化壳聚糖，搅拌，完全溶解后，再加入甘油、氯化钙和纳他霉素，搅拌均匀，得到混合溶液，超声脱气，复合膜液流延成膜，在30～50 ℃烘干6 h，揭膜，得到复合膜。

1.2.4 膜性能的测定 膜厚度的测定参考GB/T 6672-2001《塑料薄膜与薄片厚度的测定机械测量法》；膜透光率的测定参考文献[27]；膜水蒸汽透过率的测定参考文献[28]；膜机械性能（拉伸强度和断裂伸长率）的测定参考GB/T 1040.1-2018 塑料 拉伸性能的测定的方法，用温控式电子万能材料试验机测定。

1.2.5 单因素实验 以结冷胶、甘油、氯化钙和纳他霉素的添加量为单因素。固定基础膜液为添加0.2 g巯基化壳聚糖膜液，研究不同添加量的结冷胶（0、0.05、0.10、0.15、0.20 g）、甘油（0、0.25、0.50、0.75、1.00 g）、氯化钙（0、0.3、0.6、0.9、1.2 g）、纳他霉素（0、0.01、0.05、0.10、0.15 g）对巯基化壳聚糖复合膜综合性能的影响。添加每种因素时，其他因素固定值如结冷胶为0.10 g，甘油为0.50 g，氯化钙为0.60 g，纳他霉素为0.05 g；单因素实验得出最佳添加量后，以最佳添加量进行添加。

1.2.6 响应面试验的设计

1.2.6.1 PB 试验设计 以拉伸强度为响应值，确定结冷胶、甘油、氯化钙和纳他霉素这四个因素对巯基化壳聚糖薄膜综合性能影响的重要性，进行试验。实验因素及水平设计见表1。

表1 Plackett-Burman 实验因素水平及编码Table 1 Factors level and coding of Plackett-Burman test

1.2.6.2 最陡爬坡实验设计 根据PB 试验及其实验结果，对显著因素效应值进行梯度设计，根据显著因素一次项的系数，正系数逐渐递增确定变化范围；负系数逐渐递减确定变化范围；能够快速经济的逼近最佳添加量区域，根据最陡爬坡实验结果确定响应面优化试验的中心点[29]。

1.2.6.3 响应面分析试验设计 根据最陡爬坡试验结果，以拉伸强度（Y）为响应值，利用Design Expert 8.0.6软件进行响应面旋转中性组合试验设计，每个因素选取三个水平，根据Design Expert 实验表进行实验，对实验数据进行二次回归拟合，分析选取因素的主效应和交互作用，然后分析确定结冷胶、甘油、氯化钙和纳他霉素的最佳添加量，实验因素及水平设计如表2 所示。

表2 响应面实验因素及水平设计Table 2 Response surface factors and levels

1.3 数据处理

采用SPSS Statistic17.0 对数据进行显著性分析；采用Design-Expert 8.0.6 软件进行响应面试验设计和数据分析。

2 结果与分析

2.1 巯基化壳聚糖的巯基含量

通过Ellman’s 试剂法得到标准曲线方程为A=2.5501C+0.0539（A 为吸光度，C 为巯基浓度μmol/mL）；决定系数R2=0.9984。通过标准曲线计算得到，巯基化壳聚糖中巯基含量为156.11 μmol/g，表明壳聚糖经过巯基化改性成功接入了巯基基团。巯基化壳聚糖可直接溶于水，与结冷胶混合，可进行下一步研究。

2.2 单一膜力学性能的测定

单一壳聚糖膜拉伸强度为0.928 MPa，但断裂伸长率仅为5.91%；单一巯基化壳聚糖膜拉伸强度为0.350 MPa，断裂伸长率为14.47%。由结果可知，单一的壳聚糖膜及巯基化壳聚糖膜的力学性能相对较差，需要进一步改性以提高其力学性能。

2.3 单因素实验结果

2.3.1 结冷胶添加量对复合膜性能的影响 由表3可知，随着结冷胶含量的增大，拉伸强度不断增加，然而当结冷胶添加量为0.20 g 时，拉伸强度下降，推测可能因结冷胶添加过多，膜液过于粘稠，不易流延成膜，导致膜的厚度不均匀，拉伸强度不佳，这与李梦琦等[30]研究结果类似；其断裂伸长率稍有降低，差异不明显；水蒸汽透过率逐渐降低，这可能是由于结冷胶与其他复合物之间形成了致密的结构，膜的自由体积减少，水分扩散困难，从而使膜阻水性增强。由表3可看出结冷胶添加量为0.15 g 时，复合膜的机械性能整体较好。因此，结冷胶的添加量以0.15 g 为最佳。

表3 结冷胶添加量对膜性能的影响Table 3 Effect of gellan addition amount on film performance

2.3.2 甘油添加量对复合膜性能的影响 由表4 可知，随着甘油添加量的增加，膜的力学性能增强，因为甘油作为一种含有多羟基亲水基团的小分子，具有较强的亲水性，其分子内部的羟基与壳聚糖分子中的羟基结合形成链间氢键，从而减少壳聚糖分子内部间的作用力，改善柔化了巯基化壳聚糖的刚性结构，使膜更加柔软，增加其柔韧性，所以断裂伸长率逐渐增大，而复合膜的拉伸强度先增大后逐渐减小[31]。随着甘油浓度的增加，膜的溶胀度降低，水蒸汽透过率逐渐增加，这可能是因为甘油分子的加入，膜的结构变得松散且由于甘油分子在基质中不易挥发，增加了膜的极性从而增大膜的透水能力[32]。

表4 甘油添加量对膜性能的影响Table 4 Effect of glycerin addition amount on film performance

此外，随着甘油浓度的增加，膜的透光率先增加后减小。因此，当甘油添加量高于0.5 g 时，膜开始变得十分软黏，相应拉伸强度明显减小，再综合考虑膜的溶胀度和水蒸汽透过率，故选取甘油添加量为0.5 g 为宜。

2.3.3 氯化钙添加量对复合膜性能的影响 由表5可知，随着氯化钙浓度的增加，膜的拉伸强度以及断裂伸长率均先增加后减小；当氯化钙添加量增加到0.3 g时有最大值，这可能是因为氯化钙作为交联剂，使复合膜中的大分子连接更为紧密，分子链间的交联密度增大从而使其机械强度提高[33]。但氯化钙超过一定浓度，使得交联浓度过大，反而减小膜的延展性，变得硬脆，同时钙离子游离于膜中，拉伸强度降低。

表5 氯化钙添加量对膜性能的影响Table 5 Effect of calcium chloride addition amount on film performance

随着氯化钙浓度的增加，复合膜的水蒸汽透过率逐渐降低；膜的透光率随着氯化钙浓度增加而减小，因为随着氯化钙浓度的增加，厚度逐渐增大，使得透光率逐渐减小；氯化钙交联使得膜的亲水性降低，并形成不溶于水的凝胶，氯化钙作为交联剂会提高透水性，从而降低阻湿性，不利于食品的贮藏保鲜。

综上分析，氯化钙作为交联剂，可以明显地改善膜的机械性能，但氯化钙浓度过高，反而会降低膜的力学性能，综合各性能分析，选取氯化钙添加量为0.3 g 为宜。

2.3.4 纳他霉素添加量对复合膜性能的影响 结果如表6 所示。

表6 纳他霉素添加量对膜性能的影响Table 6 Effect of natamycin addition amount on film performance

由表6 可知，纳他霉素的添加对于膜的机械性能无显著影响，拉伸强度和断裂伸长率随着纳他霉素浓度的增加呈先增加后降低的变化趋势，但整体变化不显著；膜的水蒸汽透过率与透光率有明显的降低，这可能是因为纳他霉素添加量的增加使得薄膜的结构更加致密所致。当纳他霉素添加量达到0.01 g时，膜的拉伸强度、断裂伸长率及透光率最佳。因此，选取纳他霉素的添加量为0.01 g 为宜。

2.4 响应面试验结果

2.4.1 Plackett-Burman 试验结果 在单因素实验的基础上，设计PB 试验，PB 试验设计及结果见表7，方差分析见表8。从方差分析表中可看出，此回归模型的主效应P值为0.0331 小于0.05，表明模型显著，拟合性良好，表明PB 试验设计因素在所选取的水平范围内对拉伸强度的作用显著，同时决定系数为0.9965，调整决定系数为0.9810，说明回归模型设计可靠。另外，由表8 可知，对拉伸强度有显著作用的因素有结冷胶、甘油以及氯化钙，结冷胶和甘油对拉伸强度的影响呈现正效应，而氯化钙和纳他霉素则为负效应，而纳他霉素对拉伸强度的影响不显著。

表7 Plackett-Burman 实验设计结果Table 7 Plackett-Burman design of experiment results

表8 PB 实验方差分析Table 8 Efficiency evaluation of Plackett-Burman experiment

2.4.2 最陡爬坡试验结果 根据Plackett-Burman 试验结果，最陡爬坡试验设计与结果如表9 所示。随着结冷胶、甘油和氯化钙添加量的变化，膜的拉伸强度呈现增大后减小的趋势。结冷胶添加量为0.175 g、甘油添加量为1.000 g、氯化钙添加量为0.200 g 时，拉伸强度达到最大值，说明此时比较接近最佳响应区。因此以结冷胶添加量为0.175 g、甘油添加量为1.000 g、氯化钙添加量为0.200 g 作为试验的中心点，设计响应面试验。

表9 最陡爬坡实验设计与结果Table 9 Design and results of the steepest ascent experiment

2.4.3 响应面试验结果与分析 响应面试验设计方案及结果见表10、表11。利用Design-Expert 8.0.6 软件对表11 试验数据进行回归分析，得到回归模型：拉伸强度=-54.43775+434.84A+41.18125B+12.5725C+54.5AB+71AC-5.75BC+1418.4A2-25.475B2-58.4C2。

表10 Box-Behnken 设计方案及结果Table 10 Design and results of Box-Behnken experiments

表11 回归方程方差分析Table 11 Variance analysis of regression equation

从表11 可看出，本试验的模型极显著（P＜0.0001），失拟项不显著（P=0.3275＞0.05），说明该回归模型能够很好的拟合试验结果。该模型的校正决定系数R2Adj=0.9597，R2=0.9824，说明该模型能够解释95.97%的响应值变化，因而该模型拟合程度良好，试验误差小，该模型可以用于筛选出复合膜的最佳配比。由回归模型可看出，A、B、C、AB、AC、A2对拉伸强度为正效应，BC、B2、C2对拉伸强度为负效应，其中B、C、A2、B2、C2对复合膜拉伸强度的影响是极显著的（P＜0.01），A、AB、对复合膜拉伸强度的影响是显著的（P＜0.05），AC、BC 对复合膜拉伸强度的影响是不显著的（P＞0.05）；从交互系数可以看出结冷胶和氯化钙添加量的交互作用＞结冷胶和甘油添加量的交互作用＞甘油和氯化钙添加量的交互作用。

2.4.4 各因素之间的交互作用 从响应面可以直观的看出，图1 曲面陡峭，同时等高线为椭圆形，说明结冷胶和甘油添加量的交互作用对响应值的影响显著（P＜0.05）；图2 等高线稀疏近圆形，说明结冷胶和氯化钙添加量的交互作用对响应值的影响并不显著（P=0.0909＞0.05）；由图3 可知，甘油和氯化钙的添加量对响应值影响的响应面图等高线近圆形，说明甘油和氯化钙添加量的交互作用对响应值的影响不显著（P=0.4302＞0.05）。

图1 结冷胶与甘油交互作用对复合膜拉伸强度影响的响应面和等高线Fig.1 Response surface plot and contour line of interaction between gellan gum and glycerin on tensile strength of composite film

图2 结冷胶和氯化钙交互作用对复合膜拉伸强度影响的响应面和等高线Fig.2 Response surface plot and contour line of interaction between gellan gum and calcium chloride on tensile strength of composite film

图3 甘油和氯化钙交互作用对复合膜拉伸强度影响的响应面和等高线Fig.3 Response surface plot and contour line of interaction between glycerin and calcium chloride on tensile strength of composite film

随着结冷胶、甘油以及氯化钙添加量的增加，复合膜拉伸强度都是先增加后减小。结冷胶和巯基化壳聚糖都属于多糖类化合物，混合后相容性较好，分子间氢键更加紧密的结合，使得膜的综合性能发生变化。随着结冷胶含量的增加，溶质不容易充分溶解，从而影响结冷胶和巯基化壳聚糖分子间氢键的形成，作用力有所下降，影响复合膜的致密性，使得复合膜拉伸强度下降。甘油是一种增塑剂，能够进入高聚物分子链间，破坏高聚物分子间的相互作用，增加分子链的流动性，提高膜的延展性[34]，但是过量的甘油会减小巯基化壳聚糖与结冷胶分子间的作用力，导致复合膜的力学性能下降，所以甘油的添加了应控制在一定的范围内，以确保成膜具有较好的机械性能。氯化钙作为交联剂，能够使分子间形成致密的网状结构，使复合膜中的大分子连接更为紧密，分子链间的交联密度增大从而使得复合膜的机械强度提高，但当氯化钙超过一定量，交联浓度过大，反而减小膜的延展性，复合膜变的硬脆，同时钙离子游离于膜中，使得拉伸强度降低。因此，结冷胶、甘油以及氯化钙的添加量都应控制在一定范围，复合膜的拉伸强度才能达到最大值。

通过响应面模型得到复合膜的最佳配比为结冷胶添加量为0.18 g，甘油添加量为0.98 g，氯化钙添加量为0.17 g，预测复合膜拉伸强度为5.066 MPa。

进一步验证响应面分析方法的可靠性，同时为了方便实际操作将最优配比调整为结冷胶添加量为0.18 g，甘油添加量为1.00 g，氯化钙添加量为0.17 g，在此最佳配比条件下，进行3 次验证性试验，测得复合膜拉伸强度的平均值为4.986±0.087 MPa，与预测值5.066 MPa 基本一致。因此，通过Box-Behnken试验得到的最佳配方配比较可靠，具有实际应用价值。

3 结论

以巯基化壳聚糖为成膜基质，再复配结冷胶改善其性能，以甘油为增塑剂，氯化钙为交联剂，纳他霉素为抑菌剂，制备出综合性能良好的改性壳聚糖复合膜。通过单因素实验与Plackett-Burman 试验，对复合膜性能的影响大小为：氯化钙＞结冷胶＞甘油＞纳他霉素；通过最陡爬坡试验与Box-Behnken 响应面试验，建立复合膜拉伸强度相对与结冷胶添加量、甘油添加量以及氯化钙添加量的二次多元回归方程，确定最优配比：结冷胶添加量为0.18 g，甘油添加量为1.00 g，氯化钙添加量为0.17 g，纳他霉素0.01 g。在此条件下，复合膜拉伸强度的预测值为5.066 MPa，进行3 次验证性试验，测得复合膜拉伸强度的平均值为4.986±0.087 MPa，表明该数据模型对复合膜拉伸强度有较好的预测能力。该试验结果表明巯基化壳聚糖复配结冷胶、甘油、氯化钙以及纳他霉素，能够增强复合膜的机械性能，预期能广泛应用于食品保鲜领域。