茶树CsLOG基因家族的鉴定和表达模式分析

田松群，姚新转，张宝会，吕立堂,*

(1.贵州大学农业生物工程研究院/生命科学学院，山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室/山地生态与农业生物工程协同创新中心，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学茶学院，贵州 贵阳 550025)

茶树是一种重要的经济作物[1]，侧枝上的芽叶是其主要的生产器官，丰富的叶芽数量是获得高产量和高质量的关键因素[2]。茶树的顶端优势很明显，抑制了侧芽的生长，且茶树生长发育受干旱、冷胁迫等环境影响，制约茶园生产发展[3]。

细胞分类素(CKs)在消除顶端优势、促进腋芽生长和促进枝条生长发育中有重要作用[4]。LONELY GUY(LOG)是植物激素细胞分裂素(CK)激活酶，在植物的生长发育、响应环境胁迫中有重要作用[5,6]。研究表明，LOG酶指导茎节细胞分裂素的合成，促进腋芽生长[7]。植物细胞分裂素在植物中以具有生物活性的游离碱形式存在，如iP、tZ形式[8,9]，结合物则活性较低或无活性，充当储存来源[10]。内源性细胞分裂素的合成酶有异戊烯基转移酶(IPT)和特异性磷酸氢水解酶(LOG)[11]，IPT首先合成CKs初始产物异戊烯基腺苷和顺式玉米素核苷-5-磷酸，转化为没有生理活性前体物质；LONELY GUY(LOG)是一种在细胞分裂素特异性磷酸酯水解酶反应中将N6位修饰的腺嘌呤AMP衍生物转化为腺嘌呤游离碱(细胞分裂素)和5-磷酸核糖的酶[12]，从而把前体物质转化为具有活性的细胞分裂素[13]。

目前，已鉴定9个拟南芥LOG基因、11个水稻LOG基因[14]，13个毛白杨LOG基因家族成员[8]。通过qRT-PCR对拟南芥茎、茎生叶等组织器官LOG表达情况分析，发现7个LOG基因在根和茎中表达，LOG8表达量最高[14]。基因功能研究表明，拟南芥LOG7抑制细胞分裂素的激活，影响茎尖分生组织的生长，LOG7、LOG3和LOG4则对初生根生长发挥作用；有研究表明：LOG多突变体使得芽和根系生长严重受阻，其具有维持根尖缺陷分生组织的作用[15]；Chickarmane等研究表明AtLOG4在顶端和花序分生组织的表皮层中表达，AtLOG7在结节原基中表达，表明LOG可能起到在分生组织中指导细胞分裂素合成作用[16]；在水稻中，LOG功能的缺失会迅速终止侧生分生组织的产生[17]；紫花苜蓿MtLOG1、MtLOG2与根瘤原基发育和侧根形成有关[18]；Filippo Moramarco等研究结果推测，BP1253新型LOG响应氧胁迫[19]。但目前对LOG响应生物及非生物胁迫的研究还很少。

茶树生长受到干旱、低温等多种逆境胁迫。关于茶树LOG家族基因及其逆境相关的研究尚未报道。本试验对茶树LOG家族基因进行基因组鉴定，并用鉴定到的茶树、拟南芥以及杨树LOG基因构建进化树，进一步对其基因结构和启动子顺式作用元件等生物信息进行分析，分析各组织及其逆境下的表达差异，为茶树LOG家族基因及其抗逆响应中的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 茶树 LOG 家族基因的筛选与序列分析

从茶树(http://tpia.teaplant.org/)和拟南芥(https://www.arabidopsis.org/)数据库中获取茶树和拟南芥的全基因组数据、DNA、CDS、启动子序列、染色体定位信息[14]。以拟南芥9个LOG基因蛋白序列作为种子序列在TPIA数据库中进行BLASTP比对，筛选并获得假定的茶树LOG基因家族序列[11,14]。利用Pfam数据库(http://pfam.janelia.org/)和NCBI保守域数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)将所有获得的推定的茶树LOG基因序列进行保守结构域的鉴定，剔除冗余序列，最终得到茶树LOG基因。LOG基因的命名基于其与拟南芥基因同源度及染色体顺序命名。用ExPASy Compute pl/Mw工具(http://web.expasy.org/compute_pi/)计算蛋白质的分子量(Mw)和等电点(pI)[20]。用PSORT工具(http://psort1.hgc.jp/form.html)植物来源预测蛋白质亚细胞定位。

1.2 系统进化树和蛋白质保守基序分析

在MEGA-X软件中，使用近邻连接方法(Boostrap=1000)构建系统发育树[13,14]。通过MEME(http://meme-suite.org/)进行保守结构域分析，motif数目设置为15个，motif宽度范围设置为6～50氨基酸[21]。

1.3 染色体分布和启动子顺式作用元件分析

利用 HMM 3.0 软件中的 perl 脚本从茶树的基因组注释信息中获取CsLOG基因在染色体上的起始位置信息。在茶树数据库截取CsLOG基因上游2kb基因序列，并通过PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对顺式作用元件进行分析[22]，最后利用 Tbtools 进行可视化。

1.4 表达模式分析

根据鉴定出的茶树CsLOG基因的编号，在TPIA(http://tpia.teaplant.org)数据库上下载它们在茶树不同组织(包括顶芽、嫩叶、成熟叶、老叶、花、茎、根)、盐胁迫、PEG诱导的干旱胁迫、茉莉酸甲酯处理和冷胁迫后的转录组数据(TPM值)，利用TopHat和Cufflinks进行转录组reads的全基因组映射(Mapping)，计算各个CsLOG基因的FPKM值归一化处理并使用Office软件制图[23]。

2 结果与分析

2.1 茶树LOG基因家族成员鉴定及理化性质预测

将比对的候选基因提交到SMART、Pfam、NCBI-CDD等在线网站进行保守结构域验证，共鉴定到13个茶树LOG基因，并根据基因在染色体的位置及其同源关系将其命名。进一步对茶树LOG基因编码的蛋白质进行理化性质分析(表1)，结果显示：茶树LOG蛋白平均含有210个氨基酸残基，其中CsLOG2a最短，含有153个氨基酸残基；相对分子量为17.1(CsLOG2a)～24.52(CsLOG6a)kD之间；理论等电点(pI)介于4.62(CsLOG1a)～8.38(CsLOG1b)之间，同时发现 pI<7的CsLOG蛋白达到 84.6%(11个)，表明大部分CsLOG蛋白富含酸性氨基酸。11个基因成员定位在细胞质和细胞核中，另外，LOG7a同时定位到细胞质和线粒体基质中，其余2个基因CsLOG5b和CsLOG5c定位到线粒体基质外，表明这3个基因可能在细胞中行使不同的功能。

表1 茶树CsLOG基因家族基因的特征

2.2 茶树LOG系统进化、基因结构和保守结构域分析

为明确茶树LOG家族成员的分类，将拟南芥LOG基因和杨树LOG基因的蛋白序列和茶树CsLOG蛋白进行多序列比对并构建进化树。结果发现茶树CsLOG基因和拟南芥、杨树同源性很高，表明LOG基因物种分化非常保守，蛋白序列的相似性表明这三个物种的LOG基因可能具有相似的生物学功能。根据拟南芥和杨树的同源基因分类，将茶树LOG家族分为两个亚族(G1、G2)(图 1)。CsLOG6a、CsLOG8a、CsLOG9a和拟南芥AtLOG8、AtLOG9为一簇(G1)，具有很高的同源性，其余基因成员为一簇(G2)。根据系统进化树分析，LOG基因不仅在茶树、拟南芥及杨树中都存在，且同源性较高，表明LOG基因在物种分化过程中具有较高的保守性，进化时间也要早于茶树、拟南芥和杨树的分化时间。

图1 茶树，杨树和拟南芥LOG基因家族的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of LOGs in tea, poplar and arabidopsis

为深入了解茶树LOG家族基因的功能，利用茶树LOG基因组DNA序列和CDS序列对其基因结构进行分析(图 2)。利用MEME软件对茶树LOG家族基因的保守基序组成和数目进行分析，鉴定到7个比较保守的motif(motif 1～7)，另外每个基因都含有motif 1、motif 3、motif 4和motif 6。

图2 茶树LOG基因的系统进化(A)，保守功能结构域(B)，保守蛋白基序(C)和基因结构(D)Fig.2 Phylogenetic relationships (A), conserved functional domain(B), the conserved protein motif(C), and basic gene structure (D) of LOGs in tea

2.3 染色体定位和启动子顺式作用元件分析

根据茶树基因组染色体注释信息，将鉴定到的CsLOG基因进行染色体定位(图3)。结果显示，茶树LOG基因未分布到7条染色体(1、2、5、6、7、8和15号)；2个CsLOG(CsLOG5b，CsLOG5c)基因不能定位到染色体上，其它11个CsLOG基因不均等地定位到不同染色体上，染色体最多含有3个LOG基因，为10号染色体，11号染色体含有2个，其余均仅含有1个CsLOG基因。说明CsLOG基因在染色体上并非均匀分布。

图3 茶树CsLOG基因在染色体上的定位Fig.3 Localization of CsLOGs in chromosome of tea plant

本研究利用茶树LOG基因上游2000 bp的基因组序列，对CsLOG基因顺式作用元件进行分析(图4)。结果显示，CsLOG启动子中鉴定出含有多个与光相关的元件，如G-box、Box 4、MYB类和TGACG-motif等。同时，与激素响应相关元件的种类较多，如脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)，生长素(auxin)等。另外还预测到大量响应非生物胁迫的顺式作用元件：干旱响应元件MBS，厌氧诱导ARE，低温，盐胁迫DRE元件，低温响应元件LTR和防御和应激反应元件TC-rich repeats(图4)，这些元件的存在表明LOG是植物反应的重要调控因子。CsLOG3a、CsLOG1a、CsLOG2a和CsLOG9a等中呈多个富集现象，如CsLOG5b有干旱响应元件两个。对它们启动子中所含的顺式作用元件进行统计分析，可以看出，CsLOG中富含大量响应激素类及非生物胁迫等的作用元件，说明CsLOG与茶树的生长发育及逆境胁迫响应密切相关。

图4 CsLOG 基因的顺式作用元件分析Fig.4 Prediction on cis-acting elements in CsLOGs注：low-temperature低温胁迫；auxin生长素响应；anaerobic induction厌氧诱导；light responsive光响应；salicylie acid水杨酸响应；abscisic acid脱落酸响应；gibberellin赤霉素响应；MeJA茉莉酸甲酯响应；dehydration, low-temp, salt stresses脱水低温盐胁迫；defense and stress防御与应激胁迫；drought干旱诱导。

2.4 CsLOG基因在茶树中的表达模式分析

为进一步明确CsLOG在茶树中的组织表达特异性，我们从TPIA中下载它们在茶树顶芽、嫩叶、成熟叶、老叶、根、茎、花和果等8个组织转录组TPM表达数据，并对它们进行分析。结果显示(图5)，CsLOG1(a/b/c)、CsLOG5a、CsLOG8a及CsLOG9a、在各个组织中表达较为显著。在老叶中CsLOG1(a/b/c)表达高；嫩叶及成熟叶CsLOG5a表达量最高；顶芽CsLOG5a、CsLOG6a和CsLOG9a相对表达量高；花CsLOG(8a、9a)表达较显著，茎中CsLOG(5a、9a)表达高。以上结果表明，LOG基因在芽、叶和花中表达差异明显。CsLOG2a、CsLOG3a、CsLOG4a及CsLOG7a等4个基因具有花表达特异性，CsLOG5(b/c)、CsLOG3a、CsLOG4a、CsLOG2a及CsLOG7a在成熟叶中检测不到表达。这说明不同的CsLOG基因可能在茶树的不同组织部位发挥作用。

图5 茶树 CsLOG基因在顶芽、花、果、幼叶、成熟叶、老叶、根和茎表达模式Fig.5 Expressions of CsLOGs in apical buds, flowers, fruits, young leaves, mature leaves, old leaves, roots, and stems of tea plant

对CsLOG基因在干旱、盐、冷及茉莉酸甲酯胁迫处理后的表达数据进行分析，结果显示，在干旱胁迫下，与其他基因的表达水平相比，CsLOG5a、CsLOG8a和CsLOG9a的表达量较高，其中上调基因(CsLOG5a和CsLOG9a)，下调有CsLOG1(a/b/c)，CsLOG6a和CsLOG8a；CsLOG2a和CsLOG7a不受干旱胁迫处理的调控(图6A)。

在盐处理下，CsLOG5a、CsLOG9a基因的表达量在盐胁迫中上调，CsLOG8a上调，在处理48h后下调，CsLOG1(a/b/c)、CsLOG6a个基因下调；CsLOG2a、CsLOG7a不受盐胁迫的调控(图6B)。

在冷处理下，CsLOG5a和CsLOG8a的表达量被诱导微下调再上调，CsLOG1(a/b/c)持续下调，CsLOG2a、CsLOG3a、CsLOG4a和CsLOG7a不受冷处理的调控(图6C)。

在茉莉酸甲酯诱导下，7个基因CsLOG1(a/b/c)、CsLOG3a、CsLOG4a、CsLOG5a、CsLOG6a表达量被诱导上调，而CsLOG5b、CsLOG5c和CsLOG9a表达水平下调，其中CsLOG8a在处理24 h前被下调，48 h上调。同时发现CsLOG2a和CsLOG7a表达变化不受MeJA处理的调控(图6D)。

图6 CsLOG基因在不同胁迫处理的表达模式Fig.6 Expressions of CsLOGs under various stress treatments

3 讨论与结论

LOG基因家族已在多个物种中被鉴定。其中，杨树13个[8]，桃7个成员[8]，水稻有10个[12]，大白菜17个[13]，拟南芥9个[14]，紫花苜蓿有6个[18]，草莓9个基因成员[25]。本研究基于全基因组共鉴定出13个茶树CsLOG基因。11个基因成员定位在细胞质和细胞核中，与拟南芥AtLOG定位结果一致[14,24]，LOG7a同时定位到细胞质和线粒体基质中，其余两个基因CsLOG5b和CsLOG5c定位到线粒体基质外，说明这三个基因可能在细胞中行使不同的功能。基因结构和保守基序分析发现，除LOG2a保守基序所在位置靠近N端以及内含子数少外，LOG基因结构高度保守。motif1为MHxRKAxMxFxALPGGYGTxxEE是LOG保守结构域[14,22]，为LOG蛋白特征序列，决定LOG蛋白功能[26]。

本研究表达模式分析发现茶树CsLOG基因表现组织特异性。CsLOG9a、CsLOG5a、CsLOG8a、CsLOG1(a/b/c)在各个组织中表达较高。相对于其他组织CsLOG6a顶芽中表达最高，具有明显的组织特异性；嫩叶及成熟叶中CsLOG5a表达量最高；老叶终CsLOG1(a/b/c)表达最高；花中CsLOG8a和CsLOG9a表达最高。综上表明，LOG基因在顶芽、叶和花表达较高，结果与拟南芥大部分基因在根和茎中表达有差异[14]，芽的生长会促进后期花的发育，茶树LOG基因可能参与芽及叶的生长，而后促进茶树花生成。研究表明，细胞分裂素激活酶LOG是植物芽及根尖分生组织活性的重要调节剂[16]。组织特异性分析结果表明，CsLOG5a、CsLOG6a分别在叶及芽中特异性表达可能参与茶树叶芽的发育及调控作用。

茶树CsLOG基因参与响应干旱、冷胁迫、盐胁迫和茉莉酸甲酯胁迫响应等。研究证明LOG与环境胁迫响应相关，微生物中与LOG二型蛋白同源的结核分枝杆菌BpLOG酶与氧化应激负调控相关，BpLOG突变菌株对氧化应激敏感性低于野生型[19]。高等植物中，草莓FvLOG9个基因家族成员受干旱、高温和高盐胁迫调控，其中FtLOG1、FtLOG2、FtLOG5、FtLOG6和FtLOG9在各个组织中表达量均显著高于其他基因[25]。CsLOG基因启动子顺式作用元件分析CsLOG基因含有多种光调控相关元件，与草莓LOG基因家族一致[25]，可以推测光照与茶树细胞分类素的含量密切相关[27]；CsLOG5a和CsLOG9a含有低温，防御与应激等非生物胁迫响应相关元件，在不同胁迫处理下，除低温处理外CsLOG5a和CsLOG9a的相对表达量高。茶树CsLOG基因不同胁迫的差异表达，推测CsLOG基因参与干旱、冷胁迫、盐胁迫和茉莉酸甲酯胁迫响应。这些结果表明CsLOG广泛参与茶树的生长发育和非生物逆境胁迫响应。

生物化学研究明确LOG基因编码细胞分裂素激活酶，植物研究表明LOG基因在植物芽发育中具有重要调节作用[15,16]，本研究基于茶树基因组鉴定出13个CsLOG基因，并分析其生物信息学特征，表达模式分析显示CsLOG5a，CsLOG6a可能参与茶树叶芽发育，CsLOG5a、CsLOG9a在不同胁迫下相对表达量较高，它们可能在茶树生长发育及逆境胁迫响应中发挥重要功能。然而茶树LOG基因家族对激素及其逆境胁迫响应的具体机制尚不明确，需要进一步探究其原理。