碳点-二氧化锰纳米复合材料的制备及硫普罗宁的荧光传感

王 琦 司亚鑫 杨 田 高荧羲 高晓锋 朱 彬 马春蕾

(太原工业学院化学与化工系，太原 030008)

0 引言

硫普罗宁(tiopronin，TPN)是一种人工合成的氨基硫醇，它是临床上治疗胱氨酸尿症、类风湿关节炎、肝紊乱等疾病的重要药物[1-3]。此外，由于TPN分子中存在活性巯基，其具有消除自由基、抵抗氧化压力的作用[4-5]，而巯基与重金属离子的结合作用，也使得其成为一种临床上常用的解毒剂[6-7]。TPN的分子结构如图1所示。

图1 TPN的分子结构Fig.1 Molecular structure of TPN

然而，过量地服用或不当地使用TPN也可能会引起诸如肠胃不适、味觉失灵、肌无力、尿蛋白等副作用[8-10]。因此，建立便捷、灵敏的分析方法来测定生物体液中的TPN含量具有重要意义。截至目前，研究者们设计开发了众多测定TPN的方法，包括高效液相色谱法[11-12]、电化学测定法[13]、化学发光法[14]、分光光度法[15]、磷光光谱法[16]、荧光光谱法[17-18]等。其中，荧光分析法由于快速、灵敏的优点备受青睐。

二氧化锰纳米材料(Nano-MnO2)具有低成本、高比表面积、摩尔消光系数大、生物相容性好等优点[19-21]。此外，Nano-MnO2还具有优开的光吸收性能和快速电子转移能力，这就赋予了它们作为荧光猝灭剂高效猝灭荧光的能力[22]。基于此，多种MnO2纳米材料被开发并与荧光材料构建复合荧光体系，通过荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)、静态猝灭效应(static quenching effect，SQE)和内滤效应(inner filter effect，IFE)等途径实现了荧光猝灭[23-25]。另一方面，活性巯基能够与MnO2发生特开性的氧化还原反应，使得后者降解为锰离子[26-28]，失去了MnO2的性能，这就为基于MnO2的荧光复合体系提供了新颖的传感模式。

基于上述研究，我们以聚烯丙胺盐酸盐(PAH)为反应底物，通过一步水热法制备了荧光碳点(carbon dots，CDs)，基于高锰酸钾处理纳米材料的技术[29]，在CDs溶液中加入高锰酸钾，通过原位氧化还原反应制备得到了CDs-MnO2纳米复合材料。MnO2通过SQE和IFE有效地猝灭了CDs的荧光，而在复合体系中引入TPN后，由于后者分子中活性巯基与MnO2的特开反应，MnO2被降解进而使荧光恢复。由此建立了基于CDs-MnO2的荧光传感模式测定TPN的新方法。该MnO2调控的荧光开关传感原理被首次用于TPN的测定，这对TPN的分析检测是一个有效的补充。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

PAH(95%)、TPN(98%)购自阿拉丁试剂有限公司；高锰酸钾及其他试剂均为国产分析纯；实验中用水均为二次去离子水；尿液样品来自健康的志愿者，测定前过滤并稀释50倍。

所用仪器有：透射电子显微镜(Talos F200X，美国Thermo Scientific公司，加速电压200 kV、功率5 kW)；X射线光电子能谱仪(XSAM 800，英国Kratos公司，激发光源 AlKα)；纳米粒度仪(ZS90，英国 Malvern公司)；荧光光谱仪(F-7000，日本Hitachi公司，激发波长380 nm，狭缝宽度5 nm)；紫外-可见光谱仪(TU-1901，中国普析公司)；瞬态荧光光谱仪(FLS 1000，英国Edinburgh公司)。

1.2 CDs和CDs-MnO2纳米复合材料的制备

以PAH为反应底物，通过一步水热法制备荧光CDs。首先，取1 g PAH粉末溶于100 mL水中，完全溶解后转移到聚四氟乙烯反应釜中，在180℃下反应2 h。然后，将得到的淡黄色溶液冷却后转移至节流分子量为3 500 kDa的透析袋中，在去离子水中透析24 h进一步纯化产物溶液。最后，将得到的CDs溶液保存在冰箱中备用。

CDs-MnO2纳米复合材料通过原位的氧化还原反应制备而得。首先，取上述CDs溶液10 mL，在搅拌的条件下逐滴加入0.5 mL浓度为10 mmol·L-1的高锰酸钾溶液，持续搅拌反应10 min。然后将得到的棕色溶液转移入节流分子量3 500 kDa的透析袋中，在去离子水中透析24 h纯化。最后将得到的产品溶液保存在冰箱中备用。

1.3 荧光检测TPN

基于CDs-MnO2纳米复合材料的荧光检测TPN在pH=5的HAc-NaAc缓冲液中测定。将上述100 μL CDs-MnO2溶液加入到 800 μL pH=5 的缓冲液中，混匀后立即加入100 μL不同浓度的TPN溶液或去离子水(作为空白对照)中，混匀后测定其在380 nm激发下440 nm处的荧光强度。荧光光谱仪的狭缝宽度设置为5 nm。所有的测试全部平行测定3次。

1.4 尿液样品的检测

取100 μL制备好的CDs-MnO2溶液加入到700 μL pH=5的缓冲液中，再加入100 μL尿液样品和100 μL已知浓度的TPN溶液(5、15、60 μmol·L-1)中，保持最终体积为1 mL。混匀后测定所得样品溶液在380 nm激发下440 nm处的荧光强度，并计算其加标回收率。

2 结果与讨论

2.1 CDs和CDs-MnO2纳米复合材料的表征

通过TEM表征制备所得的CDs和CDs-MnO2纳米复合材料的形貌。如图2A所示，均匀分散的CDs小颗粒表明了其尺寸在5 nm以下且呈现球形。而图2B中CDs-MnO2的尺寸则明显变大且有一定程度的团聚。插图分别是CDs溶液和CDs-MnO2溶液的照片，可以看出淡黄色的CDs在复合MnO2纳米材料后溶液变为棕色。为了研究这2种纳米材料的尺寸分布，分别测试了两者的纳米粒度分布(图2C和2D)。结果表明，CDs的尺寸处于3.12～7.53 nm的范围之内，其平均粒度为4.33 nm；而CDs-MnO2的尺寸处于21.04～50.75 nm的范围之内，其平均粒度为29.74 nm。上述结果表明，以PAH为反应底物，通过水热法成功制备了CDs，且基于高锰酸钾的氧化还原反应，成功得到了CDs-MnO2纳米复合材料。

图2 (A)CDs和(B)CDs-MnO2纳米复合材料的TEM图,插图为相应溶液的照片;(C)CDs和(D)CDs-MnO2纳米复合材料的纳米粒度分布图Fig.2 (A)TEM images of CDs and CDs-MnO2 nanocomposite,insets are corresponding photos;Nanoparticle particle size distribution curves of(C)CDs and(D)CDs-MnO2 nanocomposite

进一步通过XPS研究了CDs和CDs-MnO2纳米复合材料的元素组成。CDs的XPS全谱图中可观察到 C1s、N1s、O1s的特征峰(图 3A)，证明 CDs是由 C、N、O元素组成。而在CDs的基础上，CDs-MnO2的XPS全谱图(图3B)中明显地出现了Mn2p的特征峰，证明了MnO2的复合。图3C～3F依次为CDs-MnO2中Mn2p、O1s、C1s、N1s的高分辨XPS谱图。Mn2p拟合谱图中(图3C)位于653.8和642.3 eV处的2个峰对应Mn2p1/2和 Mn2p3/2的特征峰[23]。在 O1s的拟合谱图(图3D)中，可以观察到532.2、531.0和529.7 eV三个分峰，分别对应C—O—H/C—O—C、Mn—O—H、Mn—O—Mn的结合形式[28]。C1s的拟合谱图(图3E)表明，C有3种不同的结合形式，即O＝C—OH(288.2 eV)、C—N(285.6 eV)、C—C(284.7 eV)[23]。N1s的拟合谱图(图3F)在401.2和399.1 eV处出现了分峰，分别源自于N—(C)3和C—N—C[23]。

图3 (A)CDs和(B)CDs-MnO2的XPS全谱图;CDs-MnO2的(C)Mn2p、(D)O1s、(E)C1s和(F)N1s高分辨XPS谱图Fig.3 XPS full scan spectra of(A)CDs and(B)CDs-MnO2;(C)Mn2p,(D)O1s,(E)C1s and(F)N1s high resolution XPS spectra of CDs-MnO2

2.2 TPN对CDs-MnO2荧光性能的影响

图4A为CDs-MnO2纳米复合材料的制备及荧光传感TPN的示意图。如图所示，由PAH制备而得的CDs与高锰酸钾反应后生成了CDs-MnO2纳米复合材料，且MnO2有效地猝灭了CDs荧光；TPN加入后与MnO2发生氧化还原反应使其降解，猝灭剂消失从而荧光得以恢复。基于这种传感原理，建立了以MnO2纳米材料调控荧光的方法来测定TPN。图4B所示为CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN溶液在380 nm激发下的荧光光谱。从图中可知，CDs表现出了优开的荧光性能，而CDs的荧光在复合MnO2后明显地减弱，进一步加入TPN降解MnO2后荧光又表现出一定程度的恢复。从图4C中三者在365 nm紫外灯照射下的照片能够直观地观察到溶液体系蓝色荧光的降低和恢复。

图4 (A)CDs-MnO2纳米复合材料的制备及荧光传感TPN的示意图;(B)CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN溶液的荧光光谱图;(C)CDs(1)、CDs-MnO2(2)、CDs-MnO2+TPN(3)溶液在365 nm的紫外灯照射下的照片Fig.4 (A)Scheme of synthesis of CDs-MnO2 and fluorescent sensing of TPN;(B)Fluorescence spectra of CDs,CDs-MnO2 nanocomposite and CDs-MnO2+TPN;(C)Photographs of CDs(1),CDs-MnO2(2)and CDs-MnO2+TPN(3)solutions under UV(365 nm,center)illumination

2.3 荧光传感机理研究

为了研究MnO2猝灭CDs荧光和TPN恢复荧光的机理，我们测试了 CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN溶液在440 nm处的时间分辨荧光衰减光谱(图5A)。通过多指数荧光衰减拟合数据可知(表1)，CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN的荧光寿命分别是4.33、4.66、4.81 ns。该结果表明，在复合MnO2前后及CDs-MnO2与TPN反应前后，CDs的荧光寿命并没有发生明显的变化，这说明MnO2对CDs的荧光猝灭机理属于静态猝灭[30]。此外，图5B对比了CDs的荧光激发和发射光谱图以及CDs-MnO2纳米复合材料的紫外-可见吸收光谱图。结果表明，MnO2在240～600 nm出现了宽的吸收峰，这与CDs的激发光谱和发射光谱有较大程度的重叠，这就说明IFE也对CDs的荧光猝灭起一定作用[31]。因此，MnO2对CDs的荧光猝灭是由SQE和IFE共同引起的。

表1 多指数荧光衰减拟合参数aTable 1 Fitting parametersa of multi-exponential to the fluorescence decay

另一方面，我们研究了TPN刺激的荧光恢复机理，如图5C所示，复合MnO2之后，复合材料在240～600 nm范围内出现了新的吸收带。加入TPN之后，由于其与MnO2的氧化还原反应，使得MnO2降解、消失，光谱图上也表现出宽吸收带的消失。从图5D中的照片能直观地看出，复合MnO2之后，溶液颜色变为棕色，加入TPN后棕色消失，也证明了MnO2被还原降解。因此，该荧光体系的荧光恢复机理是TPN刺激下的氧化还原反应造成了猝灭剂降解、消失。

图5 (A)CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2-TPN的时间分辨荧光衰减光谱图;(B)CDs的荧光激发、荧光发射和CDs-MnO2的紫外-可见吸收的光谱重叠对照图;(C)CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN的紫外-可见吸收光谱图;(D)CDs(1)、CDs-MnO2(2)和 CDs-MnO2+TPN(3)溶液的照片Fig.5 (A)Time-resolved fluorescence decay spectra of CDs,CDs-MnO2 and CDs-MnO2+TPN;(B)Spectral overlap of fluorescence excitation and emission spectra of CDs and UV-Vis absorption of CDs-MnO2;(C)UV-Vis absorption spectra of CDs,CDs-MnO2and CDs-MnO2+TPN;(D)Photos of CDs(1),CDs-MnO2(2)and CDs-MnO2+TPN(3)solutions

2.4 荧光测定TPN的条件参数优化

基于上述研究，TPN具有刺激MnO2分解引起荧光恢复的性能，因此CDs-MnO2纳米复合材料能够用于TPN的分析测定。由于MnO2的原位生成，荧光猝灭在生成MnO2的同时就已实现，响应时间由TPN与MnO2的反应时间决定。图6A考察了加入TPN后，CDs-MnO2体系的荧光光谱变化。如图所示，加入TPN后，荧光强度逐渐增强，最后趋于平稳。图6B为加入TPN后不同时间下的荧光恢复效率(F/F0，其中F0指的是CDs-MnO2的初始荧光强度，F指加入TPN后CDs-MnO2体系的荧光强度)。由图可知，反应1 min后荧光恢复基本趋于稳定。因此，CDs-MnO2可以快速检测TPN。此外，体系的pH值会影响TPN与MnO2的氧化还原反应，是影响TPN测定的关键因素。如图6C所示，我们分别测定了CDs-MnO2纳米复合材料及CDs-MnO2+TPN在不同pH值的HAc-NaAc缓冲液中的荧光强度。图6D为不同pH值条件下TPN对CDs-MnO2纳米复合体系的荧光恢复效率。由图6C、6D可知，当体系pH=5时，荧光恢复效率最佳。因此，为了后续灵敏度实验，我们选择该酸度作为测定TPN的最佳条件。

图6 (A)在TPN加入后CDs-MnO2在不同时间下的荧光光谱图;(B)不同时间下TPN对CDs-MnO2的荧光恢复效率;(C)CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN溶液在不同pH值下的荧光强度;(D)不同pH值下TPN对CDs-MnO2的荧光恢复效率Fig.6 (A)Fluorescence spectra of CDs-MnO2 at different times after addition of TPN;(B)Fluorescence recovery efficiency of CDs-MnO2 by TPN at different times;(C)Fluorescence intensity of CDs-MnO2 and CDs-MnO2+TPN solutions under different pH values;(D)Fluorescence recovery efficiency of CDs-MnO2 by TPN under different pH values

2.5 标准曲线和选择性

在TPN的最佳响应条件(pH=5)下，测定了不同浓度的TPN对CDs-MnO2纳米复合体系的荧光恢复效率(图7A)。结果表明，体系的荧光恢复效率与TPN 的浓度在 0.2～80 μmol·L-1的范围内呈线性关系，且符合线性方程F/F0=1.064 8+0.005 9c(R2=0.997 5)，其中c是 TPN的浓度(μmol·L-1)，检出限为0.11 μmol·L-1(3σ/S，σ为标准偏差，S为检测灵敏度)。此外，考察了CDs-MnO2纳米复合荧光体系测定TPN的选择性(图7B)。如图7B所示，TPN表现出明显的荧光恢复，而其余可能共存的金属离子和代谢产物在与TPN相同浓度时，并未对CDs-MnO2纳米复合荧光体系产生恢复。该结果证明CDs-MnO2对TPN的测定具有良好的选择性。需要指出的是，其他含巯基基团的生物分子如谷胱甘肽也能对CDs-MnO2纳米复合荧光体系产生响应[28]，然而，有报道称尿液样品中并不含有此类生物分子[32]，且生物巯基分子的干扰能够通过稀释样品而消除[16]。因此实际样品检测中能够避免其他含巯基基团分子的干扰。

图7 (A)CDs-MnO2测定TPN的标准曲线;(B)CDs-MnO2测定TPN的选择性Fig.7 (A)Linear calibration plot for TPN determination based on CDs-MnO2;(B)Selectivity of CDs-MnO2 for TPN detection

2.6 实际样品测定

由于CDs-MnO2具有良好的测定TPN的性能，该纳米复合荧光体系可用于实际人体尿液样品中TPN含量的测定，结果如表2所示。结果表明，该方法中样品的加标回收率在97.57%～102.58%范围之内，证明了CDs-MnO2纳米复合荧光体系在实际样品中测定TPN具有一定的可靠性。

表2 尿液样品中TPN含量的测定Table 2 Determination of TPN in human urine sample

3 结 论

通过PAH水热法制备得到了荧光CDs，并利用原位的氧化还原反应制备了CDs-MnO2纳米复合材料。通过静态猝灭效应和内滤效应，MnO2有效地猝灭了CDs荧光；进一步地，由于TPN的活性巯基与MnO2的氧化还原作用，使得MnO2降解、消失，进而实现荧光恢复。基于此，建立了MnO2调控的荧光传感体系来测定TPN。该纳米材料的制备方法简单便捷，荧光传感高且具有灵敏、高选择的优点。该MnO2调控的荧光开关传感原理被首次用于TPN的测定，这对TPN的分析检测是一个有效的补充。