三乙醇胺碳点的合成及其与柳氮磺吡啶相互作用的研究

王艳妮，马红燕，王文山

(延安大学 化学与化工学院；陕西省反应工程重点实验室，陕西 延安 716000)

柳氮磺吡啶(Sulfa sala zine，SSZ)是一种合成类药物，主要用于溃肠性结肠炎、各种类风湿关节炎的治疗，但是过量使用会出现头痛、厌食、恶心、呕吐等不良反应[1]。因此，分析测定生物样品中尿液和血液中SSZ的含量对人体的耐受量、吸收量、毒性和代谢具有很重要的医学意义。目前关于SSZ含量的测定有高效液相色谱法(HPLC)[2，3]，毛细管电泳-质谱联用法(CE-MS)[4]，免疫吸附法[5]，电化学法[6，7]等，但以上方法都涉及复杂的样品处理和仪器使用。荧光法也有报道，张犁黎等[8]以硫代乙酰胺(TAA)和CdSO4为原料合成CdSNPs，通过光谱研究实现了SSZ含量的测定，但CdSNPs的合成过程繁杂且镉离子有毒不易操作。因此，建立一种快速、简单、易操作的SSZ测定方法很重要。

碳量子点(CDs)作为纳米材料家族的新成员，因具有稳定的光学特性、独特的荧光性、优良的生物相容性以及细胞低毒性而被广泛地应用。随着科研工作者的不断努力，CDs的合成方法越来越多样化，主要有水热法，电化学法，微波法，激光消融法等，合成材料的选取也越来越趋于廉价和生态友好化。氮原子与碳原子大小相当，使得氮原子成为CDs合成中最理想的掺杂元素，并且氮原子外层含有5个价电子和孤对电子，可提供多余的n电子，这使得CDs的应用范围更加广泛[9]。本研究则采用微波法以TEA为碳源和氮源成功合成了水溶性碳量子点NCDs，并基于SSZ对NCDs有明显的荧光猝灭作用，建立了定量测定SSZ的新方法，并探究了猝灭机理。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

FLSP920瞬态稳态荧光光谱仪(英国爱丁堡)；8453紫外-可见分光光度计(美国安捷伦)；F-4500荧光分光光度计(日本日立)；MM823LA6-NS微波炉。

SSZ标准溶液(1.0×10-3mol/L)：准确称取柳氮磺吡啶标准品0.0398 g，用0.2 mol/L的NaOH(1.0 mL)溶解后稀释、定容至100 mL；B-R缓冲溶液(在100 mL浓度0.04 mol/L的混酸中(H3PO4-HAc-H3BO3)加入0.2 mol/L的NaOH溶液45 mL，pH=6.37)；三乙醇胺；所用试剂均为分析纯，配置好后于冰箱4 ℃保存，实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

NCDs的合成：以TEA为原料，采用微波加热的方法合成了含有碳、氮元素的NCDs。具体过程：吸量管量取10.00 mL的TEA于100 mL烧杯中，调节微波炉功率为800 kW，加热10 min后溶液变成澄清的棕色，自然冷却后在10000 rpm转速下离心10 min，再用0.22 μm的微孔滤膜过滤除去大颗粒杂质，最后用超纯水稀释50倍后作为工作液，备用。

SSZ的测定：25 ℃下，于5支25 mL比色管中分别加入1.50 mL的NCDs和1.00 mL的B-R缓冲液，一份做试剂空白，其余比色管加入不同浓度梯度的SSZ溶液，每次增加浓度为2 μmol/L。充分摇匀后，室温下静置20 min进行测定。采用1 cm石英比色皿，激发狭缝和发射狭缝均为5.0 nm，以338 nm为最佳激发波长，扫描350～600 nm范围内的荧光发射光谱图。以SSZ的浓度为0作为参照组，荧光值记为F0，计算ΔF。

2 结果与讨论

2.1 NCDs的表征

2.1.1 NCDs的荧光特征和寿命测定

碳量子点的发射峰位置和荧光强度会随着激发波长的变化而变化，因此本实验探究了不同激发波长对NCDs荧光强度的影响。从图1得知该量子点也有明显的激发依赖性，当激发波长由300 nm逐渐增加到370 nm时，发射波长从363 nm红移至410 nm，荧光强度也由强到弱发生了变化，可能是NCDs的粒径大小和表面官能团的不同引起的[10]。实验最终选择338 nm为最佳激发波长。

图1 不同激发波长下NCDs的荧光光谱

利用FLSP920瞬态稳态荧光光谱仪测定了NCDs的荧光衰减曲线，通过Origin8拟合作图(见图2)，计算得NCDs的荧光寿命为6.13 ns，χ2=1.060，说明实验数据可靠。

图2 NCDs的荧光衰减曲线

2.1.2 NCDs的稳定性和酸度影响

该方法合成的NCDs原液荧光强度较低，稀释50倍后荧光信号值达到最大。20 d后NCDs的荧光信号逐渐减弱，可能因为NCDs表面的官能团(-COOH或-OH)随着时间的延长发生脱落，从而导致荧光强度降低。但最大发射峰位置没有移动，说明量子点未发生团聚，尺寸没有太大改变。

当溶液酸度由4.35上升至7.00时，NCDs的荧光信号值逐渐增强，当溶液碱性继续增强时，荧光信号值又缓慢降低。可能是弱酸性条件下NCDs表面的羧基以-COO-和-COOH形式存在，形成氢键后更有利于羧基修饰在碳量子点表面，弥补了碳量子点表面的非辐射中心，因此在弱酸性条件下NCDs的荧光强度会最强[11]。

2.2 SSZ的测定

2.2.1 荧光光谱图

固定激发、发射波长分别为338 nm和410 nm，在室温下扫描体系的荧光光谱图如图3所示。由图可知，SSZ的加入使得NCDs最强荧光峰发生明显的降低，且NCDs的荧光强度随着SSZ浓度的增加而下降，说明SSZ和NCDs发生了结合反应从而诱导其荧光猝灭。实验发现SSZ在一定浓度范围内与体系的ΔF值呈良好的线性关系，因此可用于SSZ含量的测定。

图3 随SSZ浓度增加NCDs荧光猝灭图(1-6：cssz=0，2，4，6，8，10 μmol/L)

2.2.2 反应条件的优化

该方法合成的碳量子点原溶液荧光强度较低，稀释50倍后强度达到最大，以此作为工作液。实验研究了不同用量NCDs对体系荧光强度的影响，结果表明：当NCDs用量由0.5 mL增加至2.5 mL时(梯度为0.5 mL)体系的猝灭值也相应增大，但是相对荧光强度变化不明显，综合考虑，本实验选择加入NCDs溶液1.50 mL。同时考察了酸碱度对体系的影响，结果表明在6.37的B-R缓冲液中SSZ-NCDs体系的猝灭程度最大，且最佳用量为1.00 mL。

2.2.3 共存物质干扰

以相对误差不高于±5%为限，研究了实验过程和实际样品中可能存在物质的干扰情况。当SSZ浓度为8 μmol/L时，1000倍的Mg2+、Na+、D-果糖、乳糖、淀粉、葡萄糖，250倍的SO42+、Al3+、Cl-，100倍的Cu2+、Mn2+和10倍的Fe3+不产生干扰。

2.2.4 检出限、线性范围和样品测定

在优化的条件下，SSZ溶液浓度在0.4～10 μmol/L范围内，浓度与荧光强度线性回归方程为ΔF=31.1c(μmol/L)+4.54，R2为0.9942。对浓度为8 μmol/L的SSZ溶液平行测定5次，其相对标准偏差为0.25%。根据IUPAC规定，以3S0/S计算，方法检出限(S/N=3)为0.11 μmol/L。实验抽取两个厂家的柳氮磺吡啶片剂进行测定，回收率为97.5%～103.1%。

2.3 机理讨论

2.3.1 紫外可见吸收光谱

荧光猝灭类型一般分为动态猝灭和静态猝灭，动态猝灭是荧光分子在激发态与猝灭剂发生相互作用，静态猝灭则是荧光分子在基态与猝灭剂反应生成新的配合物，由此荧光试剂的吸收光谱发生改变。选定NCDs和SSZ溶液的浓度，以B-R作参比，分别扫描NCDs，SSZ，NCDs+SSZ在200～600 nm范围内的吸收图谱(见图4)。单一NCDs在278 nm处有明显吸收，SSZ加入后NCDs的吸光度略微增加，但吸收峰的位置没有变化，则说明SSZ的加入对NCDs的结构没有产生影响，因此判断为动态猝灭过程。

图4 紫外吸收光谱图

2.3.2 温度的影响

根据斯特恩-沃尔默方程[12]：F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]，固定NCDs的浓度扫描荧光光谱，得出不同SSZ浓度下的相对猝灭曲线。293 K下，方程为y=4.95×104x+0.9690，r=0.9993；310 K下，方程为y=5.15×104x+0.9650，r=0.9973。根据方程判断出猝灭常数KSV随着温度的升高逐渐增大，说明二者反应形成了复合物且猝灭方式为动态猝灭。

以lg[(F0-F)/F]对lg[Q]作图，拟合出不同SSZ浓度下的双对数曲线。293K下，方程为y=1.15x+5.45，r=0.9984；310 K下，方程为y=1.32x+6.30，r=0.9948。可以看出SSZ和NCDs的结合位点数分别为1.15和1.32，总体接近于1，表明SSZ和NCDs只有一个结合位点。通过计算得出KA分别为3.16×105L/mol和2.00×106L/mol，KA随着温度的升高逐渐增大，说明二者的结合力不断增强，进一步揭示该猝灭过程为动态猝灭。

依据范特霍夫方程计算出的热力学参数如表1所示，ΔH>0，ΔS>0，表明SSZ和NCDs通过疏水作用力结合，可能原因是SSZ表面的-OH和NCDs表面的-COOH发生脱水而产生的疏水作用力；ΔH>0，ΔG<0说明该反应放热、自发正向进行。

表1 NCDs-SSZ的猝灭常数、结合常数，结合位点数和热力学参数

3 结论

以乳化剂TEA为碳源，微波法一步合成了强荧光性质的NCDs，并对其光谱性质进行了研究。实验发现在pH=6.37的B-R缓冲溶液中，SSZ对NCDs的荧光强度有明显的猝灭作用，据此提出了定量测定SSZ的荧光新方法，该方法快速、易操作。猝灭机理的研究表明SSZ和NCDs之间为动态猝灭过程，反应通过疏水作用力相结合且自发进行。该碳点的合成为SSZ的定量测定提供了新思路，并拓展了量子点在药物分析方面的应用范围。