基于HPLC的益脑心颗粒特征图谱分析方法的建立

王 鑫,黄美玲,李建宏,任晓东,罗 丹,陈明会*

(1汉中市人民医院药剂科,汉中 723000;2汉中市铁路中心医院重症医学科;3西安交通大学第一附属医院药学部;*通讯作者,E-mail:951036067@qq.com)

益脑心颗粒(国药准字Z20025079,为陕西汉王药业股份有限公司独家品种)由川芎、制首乌、丹参、郁金、山楂、天麻六味中药组成,具有活血散瘀,平肝熄风等功效,用于血瘀肝旺所致眩晕头痛,心悸失眠,胸闷气短等[1-3]。方中天麻含有天麻素、腺苷、5-羟甲基糠醛、巴利森苷A等成分,具有脑保护、抗晕眩、镇静催眠等作用[4-7];丹参中含丹酚酸B、5-羟甲基糠醛、迷迭香酸等成分,有抗凝血、改善微循环等作用[8,9];温郁金具有抗血栓、抗炎等活性[10];何首乌含有二苯乙烯苷类、腺苷、没食子酸等成分,具有明显的抗衰老及神经保护、降血脂及抗动脉粥样硬化等作用[11-14];川芎含有腺苷、阿魏酸等成分有治疗心血管疾病、中枢神经系统作用[15,16];山楂含有没食子酸,具有明显的抗氧化作用[17-19]。本制剂制备工艺主要为水提与生药粉碎等[1]。该制剂在本院及研究报道中对眩晕头痛等患者临床疗效较好[20]。因此,分析本制剂的物质基础很有必要。本文参照中药特征图谱的有关技术要求[21]及运用高效液相色谱(HPLC)法对本制剂进行了研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

岛津高效液相色谱仪,型号Prominence UFLC,SPD-M20A二极管阵列检测器,LC/Labsoluion色谱工作站,日本岛津公司;KQ-5200DE台式数控超声波清洗器,昆山超声仪器有限公司;十万分之一电子分析天平,型号MS105DU,梅特勒公司;色谱柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),瑞典阿克苏诺贝尔(Akzo Nobel)公司;乙腈、甲醇,色谱级,美国Fisher公司;水为自制超纯水;其余为分析纯。腺苷(批号:HA069554,含量98.0%)、二苯乙烯苷(批号:HO118401,含量98.0%)、没食子酸(批号:HA175312,含量98.0%)、丹酚酸B(批号:HS034208,质量分数98.0%)、巴利森苷A(批号:BP1063,含量95.0%)等对照品均购自宝鸡辰光生物科技有限公司;天麻素(批号:110807-202010,质量分数95.5%)、5-羟甲基糠醛(批号:111626-202013,质量分数99.5%)、迷迭香酸(批号:111871-202007,质量分数98.1%)等对照品均购自中国食品药品检定研究院;川芎、制首乌、丹参、郁金、山楂、天麻等中药材,均购自汉中市老百姓大药房旗舰店;益脑心颗粒(国药准字Z20025079,规格15g×9袋/盒,批号010001、010002、010003、010004、010005、010006、010007、010008、010009、010010),陕西汉王药业股份有限公司生产。

1.2 特征图谱测定方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液 (B),梯度洗脱,见表1。记录时间为100 min。流速:1.0 ml/min;柱温:30 ℃;检测波长:270 nm;进样量:10 μl。

表1 流动相梯度洗脱

1.2.2 混合对照与供试品溶液的制备

1.2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品腺苷5.10 mg、天麻素5.24 mg、没食子酸5.10 mg、5-羟甲基糠醛5.03 mg、二苯乙烯苷5.10 mg、巴利森苷A 5.26 mg、迷迭香酸5.10 mg、丹酚酸B 5.10 mg置于50.00 ml量瓶中,加50%甲醇至刻度,摇匀,即得混合对照品溶液,各成分质量浓度均为0.10 mg/ml。

1.2.2.2 供试品溶液的制备 取本品3袋内容物,研细,混匀,取15.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入50%乙醇50 ml,称定质量,超声处理(功率100 W,频率100 Hz) 30 min,取出,放冷,再称定质量,用50%的乙醇补足其减失的质量,摇匀,以0.22 μm的微孔滤膜过滤,取续滤液得到供试品溶液。

1.2.3 精密度试验 取供试品溶液(批号010001),连续进样5次,分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析考察。计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积RSD值。

1.2.4 稳定性试验 取供试品溶液(批号010001),分别于各时间点即0,2,4,8,12,24 h进样,考察共有峰的相对保留时间和相对峰面积。计算各共有峰相对保留时间与相对峰面积RSD值。

1.2.5 重复性试验 取6份供试品(批号010001),按供试品溶液的制备与色谱条件进行分析,分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析考察。计算各共有峰相对保留时间与相对峰面积RSD值。

1.2.6 特征图谱建立及相似度分析 取10批益脑心颗粒样品,分别按供试品溶液的制备与色谱条件进行分析,进样量10 μl,记录色谱图,建立特征图谱。计算10批样品共有色谱峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值。参考文献[21]对10批益脑心颗粒的特征图谱进行相似度分析,将色谱工作站数据导入中药特征图谱相似度计算软件,通过计算得出样品对照特征图谱的共有模式,并以此共有模式为对照谱图R,进行整体相似度评价。

1.3 特征峰定性鉴别

1.3.1 色谱条件 同1.2.1项。

1.3.2 混合对照品溶液的制备 同1.2.2.1项。

1.3.3 供试品溶液的制备 同1.2.2.2项。

1.3.4 川芎供试品溶液的制备 取川芎粉末1 g于烧瓶中加蒸馏水100 ml,加热回流1 h,滤过,收集滤液,减压浓缩后,加入50%乙醇50 ml,超声处理(功率100 W,频率100 Hz))30 min,取出,放冷,再用50%乙醇补足其减失的质量,摇匀,0.22 μm的微孔滤膜过滤,取续滤液得到供试品溶液。

1.3.5 天麻供试品溶液的制备 取天麻粉末1 g置具塞锥形瓶中,加入50%乙醇50 ml,余同1.2.2.2项。

1.3.6 制首乌供试品溶液的制备 取制首乌粉末1 g于烧瓶中加蒸馏水100 ml,余同1.3.4项。

1.3.7 丹参供试品溶液的制备 取丹参粉末1 g于烧瓶中加蒸馏水100 ml,余同1.3.4项。

1.3.8 郁金供试品溶液的制备 取郁金粉末1 g于烧瓶中加蒸馏水100 ml,余同1.3.4项。

1.3.9 山楂供试品溶液的制备 取山楂粉末1 g于烧瓶中加蒸馏水100 ml,余同1.3.4项。

1.3.10 特征峰鉴别 分别取混合对照品、益脑心颗粒供试品以及川芎、制首乌、天麻、丹参、郁金、山楂药材供试品按色谱条件1.2.1项进样测定,对特征峰进行指认。

2 结果

2.1 精密度试验

35个共有峰的相对保留时间与相对峰面积RSD值分别小于2.0%和5.0%(见表2,3)。表明该方法精密度良好。

表2 精密度试验相对保留时间测定结果

表3 精密度试验相对峰面积测定结果

2.2 稳定性试验

35个共有峰相对保留时间与相对峰面积RSD值分别小于2.0%和5.0%(见表4,5),表明供试品溶液在24 h内具有良好的稳定性。

表4 稳定性试验相对保留时间测定结果

表5 稳定性试验相对峰面积测定结果

2.3 重复性试验

35个共有峰相对保留时间与相对峰面积RSD值分别小于1.0%和5.0%(见表6,7),表明该方法重复性良好。

表6 重复性试验相对保留时间结果

表7 重复性试验相对峰面积结果

2.4 特征图谱建立及相似度分析

10批样品共有色谱峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值均分别小于1.0%和5.0%(见表8,9),以峰18为参比物(S),对选定35个共有色谱峰进行谱峰匹配,生成对照谱图R(见图1,2),整体相似度结果相似度在0.900-0.998之间(见表10)。

1-35.特征指纹峰;1.腺苷;3.天麻素;5.没食子酸;6.5-羟甲基糠醛;17.巴利森苷A;18.二苯乙烯苷(作为参照物的色谱峰);22.迷迭香酸;24.丹酚酸B图1 益脑心颗粒HPLC对照特征图谱Figure 1 HPLC reference characteristic chromatogram of Yinaoxin granules

表8 10批样品相对保留时间结果

R. 10批拟合特征图谱;S1-10.生产批号分别为010001,010002,010003,010004,010005,010006,010007,010008,010009,010010图2 10批益脑心颗粒的HPLC特征图谱Figure 2 HPLC characteristic chromatogram of 10 batches of Yinaoxin granules

表9 10批样品相对峰面积结果

表10 10批制剂相似度测定结果

2.5 特征峰定性鉴别

特征峰1-35来自不同药材,川芎中出现特征峰1,2,4,9-11,13-16,20,23,32-34;制首乌中出现特征峰1,4,5,10,11,14-16,18,19,25,27,31-33,35;天麻中出现特征峰1-4,6-12,14,16,17,20,25,32;丹参中出现特征峰6,8,11-13,15,20-31,33;郁金中出现特征峰9,10,20,29,30-33;山楂中出现特征峰5,8,11,13,14,16,32。指认出8个特征峰分别是:峰1为腺苷、峰3为天麻素、峰5为没食子酸、峰6为5-羟甲基糠醛、峰17为巴利森苷A、峰18为二苯乙烯苷、峰22为迷迭香酸、峰24为丹酚酸B(见图3)。

A.益脑心颗粒;B.制首乌;C.川芎;D.天麻;E.郁金;F.丹参;G.山楂;H.混合对照品;1.腺苷;3.天麻素;5.没食子酸;6.5-羟甲基糠醛;17.巴利森苷A;18.二苯乙烯苷;22.迷迭香酸;24.丹酚酸B图3 供试品、混合对照品及各药材HPLC色谱图Figure 3 HPLC chromatogram of test substance, mixed reference substance and medicinal materials

3 讨论

特征图谱测定实验是使用二极管阵列检测器对益脑心颗粒样品进行全波长扫描,比较样品分别在210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330 nm波长处时测定结果,比较不同波长下色谱峰信息,如色谱峰数量、各色谱峰的分离度等,结果在270 nm时较为理想,故作为该制剂特征图谱的测定波长。主要活性成分鉴别实验依据各成分出峰时间与紫外最大吸收值,参比物二苯乙烯苷最大吸收值分别在217 nm和311 nm处,定性鉴别的其他几个成分的最大吸收值分别为腺苷(217,265 nm)、天麻素(220,269 nm)、没食子酸(218,271 nm)、5-羟甲基糠醛(232,281 nm)、二苯乙烯苷(217,311 nm)、巴利森苷A(220,270 nm)、迷迭香酸(219,311 nm)、丹酚酸B(219,288,309 nm),在270 nm时均能良好地显示色谱峰且分度符合要求。因此,综合考察后确定益脑心颗粒特征图谱检测波长为270 nm。

本制剂为中药复方,成分复杂,极性不一,所以采用梯度洗脱方法。曾选择不同品牌的反相C18色谱柱(如安捷伦XDB-C18、ZORBAX Eclipse Plus C18、Ultimate®XB C18、Intersil C18、Kromasil C18),不同规格(如250 mm×4.6 mm, 5 μm 、150 mm×4.6 mm, 5 μm)进行过比较;选择不同流动相系统[如甲醇-水、乙腈-磷酸水溶液(0.1%,0.2%,0.5%,1.0%)、乙腈-水、乙腈-醋酸水溶液(0.2%,0.5%,1.0%)等],不同柱温(25,30,35,40 ℃)、不同流速(0.5,0.8,1.0,1.2 ml/min)等;最终结果采用Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)与流动相系统乙腈-0.1%磷酸水溶液、柱温为30 ℃、流速为1.0 ml/min,在此条件下各特征峰分离度较好、经过方法考察具有良好的重复性与稳定性,故将此条件作为本方法的色谱条件。

制备供试品溶液方法的选择,本制剂中天麻为生药粉入药,其余药味均为水提取。比较了不同溶剂(乙醇、甲醇、水)及溶剂不同浓度(即0,50%,100%)、不同处理方法(加热回流,超声及其不同处理时间15,30,45,60 min)等,结果加热回流与超声提取比较,超声提取时间短且色谱峰信息丰富;而选用50%乙醇作为溶剂优于50%甲醇。因此,选择50%乙醇超声处理30 min作为本方法供试品溶液的制备方法。

在特征峰鉴别实验中,特征峰个数依次为丹参中19个>天麻中17个>制首乌中16个>川芎中15个>郁金中8个>山楂中7个。在35个特征峰中,指认出8个特征峰即腺苷、天麻素、没食子酸、5-羟甲基糠醛、巴利森苷A、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B,为继续研究该制剂的药代动力学奠定了基础。本文引言已论述,它们均具有不同的药理活性,是制剂的功效成分之一。

综上所述,经上述研究建立了益脑心颗粒的HPLC特征图谱测定方法,该方法稳定性、精密度、重复性良好,操作简单、易于实施,能够较为整体全面地反映益脑心颗粒的化学成分信息,因此该方法为益脑心颗粒质量的评价提供了参考,为制剂临床研究提供了依据。