松材线虫病双基因检测方法的建立

程维金 罗治建 陈亮 丁强 张叔勇

摘 要： 采用松材线虫的核糖体DNA的内转录区序列及cathepsin L-like cysteine proteinase为目的片段设计2对引物，建立了可特异性检测松材线虫的双基因PCR检测法。利用这2对引物，松材线虫可扩增出大小分别为490 bp及264 bp的产物，而其他对照组均无扩增。此检测方法经过实际应用检验，灵敏度与常规PCR一致，而特异性更高，可以应用于实验室的常规检测需求。

关键词： 松材线虫;双基因PCR;检测方法

中图分类号：S43   文献标识码：A   文章编号：1004-3020（2021）02-0060-04

Establishment of Two Gene-jointed PCR Detection Assay for

Bursaphelenchus xylophilus

Chen Weijin（1） Luo Zhijian（2） Chen Liang（2） Ding Qiang（3） Zhang Shuyong（4）

（1.Wuhan Forestry Station Wuhan 430023;2.Hubei Provincial General Station of Forest Pest Control and Quarantine Wuhan 430079;3.Wuhan Baolvfeng Biotechnology Co.Ltd. Wuhan 430048;4.Wuhan Institute of Virology，CAS Wuhan 430071）

Abstract： In this paper，a new two gene-jointed PCR detection assay to detect Bursaphelenchus xylophilus，was established.For developing the two gene-jointed PCR detection of B.xylophilus，two pairs of primers were designed according to sequence of B.xylophilus available in GenBank，targeting the cathepsin L-like cysteine proteinase gene and ribosomal DNA internal transcribed spacer region.The specificity，sensitivity assay and clinical samples were tested by using the optimized reaction system.Results showed that the specific fragments 490 bp and 264 bp were able to amplified，while there was no amplification product found in positive controls and other tested ones.The method was applied to detect clinical samples and the result showed 100 % consistence with PCR.These results could be served as a basis detection application in diagnosis of B.xylophilus.

Key words： Bursaphelenchus xylophilus;two gene-jointed PCR;detection

松材线虫病（Pinewilt disease）是危害松属植物的一种毁灭性病害，以松树萎蔫病为典型症状，具有发病致死速度快、传播蔓延迅速、防治难度大等特点[1]。该病由松材线虫Bursaphelenchus xylophilus引起，该病主要通过人为调运带疫的苗木、松木制品等进行远距离传播，目前最主要的防治措施是通过设立和建设无病区，加强植物检疫，严防病原传入。其中，加强松材线虫的早期诊断和检测技术的研究尤为重要。

双基因联合PCR扩增是一种特殊的多重PCR扩增技术[2]。该检测技术主要选定两个不同的靶基因分别进行特异性引物的设计，然后同时利用两对特异引物对反应体系进行优化、扩增，从而建立起两个互不干预的检测体系。双基因联合PCR擴增与常规PCR检测技术相比，2个基因的检测结果可以相互印证，有效减少了假阳性和假阴性结果的出现，具有更高的准确性。

本试验根据松材线虫的核糖体DNA的内转录区序列及基因组cathepsin L-like cysteine proteinase基因的特定区域进行两对特异性引物的设计，并成功建立了松材线虫双基因联合快速检测体系，此检测方法经过实际应用检验，灵敏度与常规PCR一致，而特异性更高，可以应用于实验室的常规检测。这为松材线虫早期诊断提供了有效方法，同时为该病害的准确防治提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

供试线虫及松木样品：松材线虫病木样本由保绿丰（湖北）生物科技有限公司于2019年夏采集自武汉黄陂、马鞍山森林公园等地;拟松材线虫、腐生性线虫病木样本采集自武汉马鞍山森林公园等地;

试剂：引物由华大基因有限公司武汉分公司合成。Taq DNA聚合酶、PCR产物回收试剂盒、DL2000 DNA Marker等均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 试验方法

线虫分离：新鲜采集的松木样品，采用贝尔曼漏斗法在浸泡4～24 h后，收集前段滤液。样品浓度不足时，滤液以1000 rpm离心10 min，弃上清，沉淀溶解于少量生理盐水中。

DNA提取：显微镜下挑取单条线虫或直接取多条线虫混合滤液，加入100 μ1松材线虫组织裂解液（2.5 mmol/L DTT、1.125% Tween20、0.025% Gelatin缓冲液）在冰上混匀，捣碎匀浆;55 ℃静置15分钟。-20 ℃长期保存。

引物设计：根据GenBank上公布的线虫核糖体DNA的内转录区序列及基因组cathepsin L-like cysteine proteinase基因分别设计两对引物，其序列为：

BxF2：5′-CGAGCAGAAACGCCGACTT-3′

BxN2：5′-AACAAACCGCAGCCAGGACTC-3′

BxCPF：5′-ACTCGGCGGTGAAACTCCAT

BxCPR：5′-CACGCGACCATCTGCTCTTC

PCR扩增：在PCR反应管中加入2 μl上述提取的组织裂解提取液、1 μl上游引物、1 μl下游引物、1 μl dNTP（10mM）、5 μl 10×Taq酶缓冲液、2U Taq酶，加ddH2O至總体积为50 μl。PCR反应条件为：94 ℃ 2 min 1个循环;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min;共 35个循环;72 ℃ 延伸 7 min。PCR扩增反应产物置于-20 ℃保存。

引物特异性验证：分别采用基于线虫核糖体DNA的内转录区序列引物对（BxF2+BxN2）及基于基因组cathepsin L-like cysteine proteinase基因的引物对（BxCPF+BxCPN），以及同时采用上述2对引物，对供试样品经行检测。

电泳检测：反应结束后，取10μ1扩增产物，加入2 μl 6×DNA加样缓冲液（含溴酚蓝）混匀，在2%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭染色剂）电泳15分钟。在紫外检测仪下观察、拍照。

序列测定及分析：PCR产物电泳检测后回收，直接送样单向及双向测序。测序由华大基因公司武汉分公司完成。所得序列通过NCBI的Blastn进行同源性分析。

双基因联合PCR扩增体系实际应用：分别从武汉市各区包括武汉黄陂、江夏、马鞍山森林公园等地采集具有松树萎蔫病症状的样本，分离线虫后按照上述方法进行双基因联合PCR扩增检测。

2 结果与分析

2.1 形态学观察

在光镜下，松材线虫呈蠕虫形，虫体细长，长1 mm左右。而腐败生性线虫则比较短肥。松材线虫雌虫尾亚圆锥形，末端宽圆，少数有微小的尾尖突。雄虫交合刺大，弓状，成对，喙突显著，交合刺远端膨大如盘。根据雌虫的指形尾可以大致区分松材线虫与拟松材线虫。

2.2 PCR扩增特异性实验结果：

基于线虫核糖体DNA的内转录区序列设计的特异性引物对PCR扩增产物电泳结果见图1。从图中可以看出样品在略大于264 bp处均出现一条清晰的主要扩增带，分子量大小与预期扩增产物基本一致。

基于线虫cathepsin L-like cysteine proteinase基因设计的特异性引物对PCR扩增产物电泳结果。从图2中可以看出样品在略大于490 bp处均出现一条清晰的主要扩增带，分子量大小与预期扩增产物基本一致。

应用双基因设计的特异性引物对对样本进行检测，同时检测结果与单一PCR结果进行比较。结果显示，双基因PCR结果与单一PCR检测结果一致（图3），表明该方法可以用作双基因同时检测出具检测结果。

2.4 PCR产物测序结果

基于线虫核糖体DNA的内转录区序列引物对（BxF2+BxN2）及基于基因组cathepsin L-like cysteine proteinase基因的引物对的PCR扩增产物，切胶回收后，经正反向测序，均得到与预期长度一致的序列，经Blastn进行同源性分析，与预期基因相似性均为100%。

2.4 PCR扩增实际应用结果

采用PCR扩增对来自武汉黄陂、江夏八分山、武汉马鞍山森林公园等地的样本进行检测，结果在武汉黄陂、江夏的样本中均检测到松材线虫阳性。

3 讨论

松材线虫在我国尚未得到有效控制，目前疫区仍在不断扩大之中。松材线虫的传统检测技术具有一定的局限性，如特异性差、灵敏度低、依赖于检测人员的经验等等，难以对病害进行早期快速准确检测。分子检测技术已经逐步在各地得到一定的应用。虽然目前已经有荧光定量PCR等技术可在标准参考实验室用于检测松材线虫[3，4]，但是对人员及设备均有较高要求，各地林业部门仍然急需适用于基层，具有操作简便、成本低廉、快速准确的分子检测技术。

基于线虫核糖体DNA内转录区序列是目前PCR扩增技术主要的种类分子鉴定靶区，具有种内变异较小而种间差别相对较大等优点[5，6]，我们自行设计的引物对可以有效区分松材线虫、拟松材线虫及腐生线虫;而基于基因组其它基因的扩增技术则相对研究较少[7，8]，此前，松材线虫相关的双重PCR技术也是根据线虫核糖体DNA内转录区序列设计[9]。因此我们根据线虫基因组cathepsin L-like cysteine proteinase基因的特定区域进行了特异性引物的设计，结合基于线虫核糖体DNA的内转录区序列引物对，成功建立了松材线虫双基因联合快速检测体系。此检测方法经过实际应用检验，灵敏度与常规PCR一致，可以应用于实验室的常规检测。

目前的松材线虫双基因联合快速检测体系，在实验室采取的是经典的琼脂糖电泳的方法来进行PCR产物的检测，在今后仍然有可能通过等温扩增及显色、杂交等可视化技术[10，11]，实现进一步升级，以满足现场检测的需求。

参考文献

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[10]王熊，周鑫昱，史文强，等.一种松材线虫快速检测的新技术[J].青岛科技大学学报（自然科学版），2019，40（3）：29-32，37.

[11]张裕君，王金成，魏亚东.可视化核酸试纸条法快速检测松材线虫[J].植物保护，2013，39（4）：94-98.

（责任编辑：唐 岚）