强氧化剂脱黑色素对免疫组化染色影响的评估

韩 雪，宋国新，唐锦玲，张炜明

黑色素瘤是临床上较为常见的皮肤黏膜和色素膜恶性肿瘤，也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一[1]。免疫组化染色是黑色素瘤病理学诊断常用的检查方法。富含黑色素的瘤组织行免疫组化染色时，组织中沉积的大量黑色素与免疫组化阳性所显示的DAB棕黄色颗粒互相干扰，影响结果判读[2]。因此，这一类组织染色前通常需要进行氧化脱黑色素处理。本实验在实践中发现强氧化剂处理切片不仅会造成组织脱片，还易破坏组织内抗原，造成假阴性结果。本文采用3组不同染色法评估富含黑色素的黑色素瘤组织中常规检测的4种抗原受氧化脱黑色素的影响程度，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集2016～2018年南京医科大学第一附属医院病理科存档的黑色素瘤标本28例，每例均重新切片，经HE染色证实组织内含有大量棕黑色色素颗粒。选取HMB-45、S-100、Melan-A、Ki-67 4种抗体作为测试抗体。实验使用的一抗、柠檬酸抗原修复液(pH 6.0)、鼠兔通用型MaxVision二抗、DAB显色试剂盒、AEC显色试剂盒均购自福州迈新公司。脱黑色素采用高锰酸钾/草酸法：0.5%高锰酸钾液，2%草酸液均为科室自配。

1.2 方法将组织连续切片14张，分为3组：(1)第1组切片不经氧化脱黑色素处理，直接行HE染色和常规免疫组化检测，DAB显色。(2)第2组切片经抗原修复后采用高锰酸钾法氧化脱黑色素，再行HE染色和常规免疫组化检测，经DAB显色。脱黑色素方法如下：组织切片水洗，根据切片中黑色素量的多少，用强氧化剂高锰酸钾液滴染5～30 min，蒸馏水冲洗；滴加2%草酸，镜下观察无色后流水冲洗，记录氧化剂氧化时间。(3)第3组切片不经氧化脱黑色素处理，直接行常规免疫组化检测，AEC显色。

2 结果

2.1 脱黑色素后免疫组化染色抗原表达直接行HE染色的切片镜下可见组织中含有大量的棕褐色颗粒(图1)，脱黑色素后行HE染色，发现这些棕褐色颗粒消失，证实这些色素颗粒为黑色素。第1组切片的免疫组化染色正常，无脱片现象发生，DAB显色的阳性结果呈棕色，与褐色的内源性黑色素相互干扰，难以准确判读(图2)。第2组切片内均无黑色素沉着(图3)，经两位高年资诊断医师阅片，与第3组相比，HMB-45、S-100、Melan-A、Ki-67总表达减弱/假阴性率分别有60%(15/25)、16%(4/25)、88%(22/25)和24%(6/25)(表1)，其中Melan-A表达受氧化脱黑色素影响程度最高，22例表达减弱甚至阴性，HMB-45次之，25例Ki-67均出现不同程度背景着色。脱黑色素后行免疫组化染色的28例组织中，13例部分脱片，合计21张切片有不同程度的掉片，其中3例完全脱片无法继续进行阅片故不纳入后续统计。第3组切片AEC红色显色与黑色素区别明显，与背景反差强，便于镜下观察(图4)。

①②③④

表1 氧化脱黑色素对抗原表达的影响(n=25)

2.2 不同脱黑色素时间与抗原表达受影响的关系25例组织按高锰酸钾氧化时间分为5 min组7例、6～15 min组13例和16～30 min组5例，各组切片4种抗原表达减弱/假阴性数及其所占本组的比例见表2，4种抗原受脱黑色素时间影响程度不一，16～30 min组受影响比例最高，6～15 min组受影响次之，5 min组受影响比例最低。大部分富含黑色素的组织经6～15 min高锰酸钾氧化后，黑色素可被有效脱掉。

表2 不同脱黑色素时间组抗原表达减弱/假阴性例数[n(%)]

3 讨论

黑色素是由黑色素母细胞产生的一种生物性色素颗粒，正常表达于人体表皮、虹膜、睫状体和脉络膜、脑膜和神经节等处，在常规HE染色中通常呈黄褐色或棕褐色[3]。组织切片中存在大量黑色素颗粒时，会掩盖细胞的结构及形态，影响镜下观察和疾病诊断，从而需要进行脱黑色素处理，尤其在行免疫组化染色时，常规的DAB棕色显色极易受黑色素干扰[2]。黑色素是一种不含铁而含硫的色素，性质稳定，完全不溶于水及有机溶剂，常规组织经固定、脱水、透明、浸蜡后也不会丢失黑色素。目前对组织中内源性黑色素的脱黑色素试剂以氧化剂类为主，如高锰酸钾等，利用氧化剂的氧化及漂白作用，打开黑色素的酚环，使之脱色[4]。现行使用较多的高锰酸钾强氧化剂脱黑色素法脱黑色素效果好，时间短，但容易掉片，既往的研究多专注于试剂浓度、脱黑色素时间的优化上，较少关注脱黑色素过程中强氧化剂对组织切片中抗原的破坏。

作者在实践中发现，部分组织经过脱黑色素处理后行常规免疫组化检测时会出现抗原表达减弱甚至假阴性的现象，且假阴性的出现率与氧化剂脱黑色素时间的长短相关，即组织中含有的黑色素越多，需要脱黑色素的时间越长，对抗原的影响亦越大。同时氧化剂对抗原的影响具有选择性[5]，即相同的氧化脱黑色素时间对不同抗原的影响程度不一致。在本组实验中有25例黑色素瘤组织的4种常用诊断抗体均出现不同程度的抗原表达减弱/假阴性反应，Melan-A表达受氧化脱黑色素影响程度最高，HMB-45次之。随着氧化剂脱黑色素时间的延长，还会出现细胞形态及结构的破坏，影响了抗原定位的准确性以及抗体与之反应的敏感性。

DAB显色剂是免疫组化染色中最常用的显色剂，显色保存长久不褪色是其最大优点，但在富含黑色素的黑色素瘤组织中，黑色素颗粒干扰DAB棕黄色阳性颗粒，影响镜下观察。氧化脱黑色素虽能脱去组织中的黑色素，但对组织中的抗原产生影响，甚至影响判读结果的准确性，因此，在富含黑色素的肿瘤组织行免疫组化检测时可采用AEC显色剂替代DAB显色剂，取消了氧化脱黑色素环节，既避免了脱黑色素过程中强氧化剂对组织的损伤，又简化了染色流程，且能取得良好的染色效果。此外，刘兴华等[6]在免疫组化DAB显色后使用H2O2去黑色素也取得较好的效果，阳性定位准确，表达清晰，提高了诊断的准确率。在日常工作中，仍需不断摸索、不断创新，寻找操作更加简便、免疫组化结果更加优良的脱黑色素方法。